5-6腎切除大鼠腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及netrin-1腎臟保護(hù)作用的研究.pdf

1、盡管腎臟疾病的根底疾病不同：腎小球腎炎、糖尿病腎病、高血壓腎病、藥物性腎病等，但一旦腎臟損傷達(dá)到一定程度，腎臟疾病的進(jìn)程多是進(jìn)行性的，不可逆的，獨立于原發(fā)損害。腎間質(zhì)的纖維化(renal interslitial fibrosis，RIF)、管周毛細(xì)血管網(wǎng)的丟失，進(jìn)而腎小管的萎縮、腎小球的硬化是終末期腎病(end-stagerenal disease，ESRD)的共同途徑。以往針對腎間質(zhì)纖維化的研究，多集中于腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞活化

2、、粘附因子的表達(dá)、炎癥細(xì)胞的浸潤。近年來腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和修復(fù)，微血管病變和腎間質(zhì)慢性缺氧及纖維化的關(guān)系已經(jīng)得到國內(nèi)外學(xué)者的共識。腎間質(zhì)微血管主要指源于出球小動脈并分布于腎小管周圍的毛細(xì)血管，即腎小管周圍毛細(xì)血管(Peritubular capillary，PTC)，腎小管周圍毛細(xì)血管在維持腎小管正常的結(jié)構(gòu)和功能起關(guān)鍵作用。近年來的研究提出，在多種腎病中，無論病因如何，均存在腎間質(zhì)微血管病變，PTC分布紊亂減少，而且PTC減少程

3、度與腎間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)。因此如何解決PTC丟失，保護(hù)腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞是治療腎間質(zhì)纖維化的重要環(huán)節(jié)。
　　 肌成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)介于成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間，比普通的成纖維細(xì)胞具有更強的增殖和分泌膠原的能力，是促成腎臟及其它器官纖維化的重要因素，而且其在纖維化部位持續(xù)存在。近來發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化和肺纖維化過程中，內(nèi)皮細(xì)胞可以向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(endothelial-myofibroblast transition，End

4、oMT)發(fā)揮了重要作用。在慢性腎臟病進(jìn)展過程中是否存在內(nèi)皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而加重腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，這是向腎臟工作者提出的新的研究方向。
　　 Netrin-1是Serafini1994年發(fā)現(xiàn)的一種主要的神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子，它是層粘連蛋白樣分子，具有明確的主要組織區(qū)域，屬于層粘連相關(guān)家族中的軸突導(dǎo)向分子。在神經(jīng)系統(tǒng)中其經(jīng)典的作用是通過與其受體DCC和UNC5H結(jié)合引導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長與誘導(dǎo)生長錐的的遷移。近來有學(xué)者發(fā)

5、現(xiàn)，由于神經(jīng)和血管分支走向的高度相似性，引導(dǎo)神經(jīng)定向生長的軸突導(dǎo)向因netrin-1也能誘導(dǎo)血管的新生。體內(nèi)、體外的研究表明netrin-1是內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂原，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，發(fā)揮誘導(dǎo)血管新生的作用，netrin-1是白細(xì)胞吸引的潛在抑制劑，能夠抑制粘膜缺氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。為應(yīng)用netrin-1保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)PTC，改善腎間質(zhì)纖維化，延緩腎臟病進(jìn)展提供契機。
　　 5/6腎切除的典型病理改變?yōu)槟I小球硬化

6、、腎間質(zhì)纖維化，表現(xiàn)與人類腎臟纖維化相一致的病理過程。是研究慢性腎臟病、腎纖維化的理想動物模型。
　　 本實驗從以下三個方面進(jìn)行了研究：①netrin-1在正常大鼠腎臟的表達(dá)定位、在5/6腎切除中大鼠腎組織中的變化及其與管周毛細(xì)血管網(wǎng)之間的關(guān)系；②腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞是否可以向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；③netrin-1對5/6腎切除大鼠腎臟的保護(hù)作用及可能機制。
　　 材料與方法：
　　 第一部分：雄性SD大鼠48只，隨

7、機分為2組：①模型組(n=24只)大鼠行10％水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術(shù)臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復(fù)位腎臟，縫合。1周后切除整個右腎，2次共切除5/6腎臟；于造模后第4、8、12周分別處死大鼠8只。②假手術(shù)對照組(n=24只)僅以水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露并剝離腎包膜，不做腎切除。于造模后第4、8、12周分別

8、處死大鼠8只。大鼠在處死前留24小時尿蛋白定量，處死時留取血及腎組織標(biāo)本。血標(biāo)本作血尿素氮、血清肌酐檢測；尿標(biāo)本行24小時尿蛋白定量；腎組織石蠟切片常規(guī)HE和Masson染色觀察腎臟組織病理改變，電鏡觀察腎小管周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察各組、各時間點大鼠腎組織netrin-1、PTC密度、HIF-1α表達(dá)情況；Western blot技術(shù)檢測netrin-1、HIF-1α蛋白的表達(dá)。
　　 第二部分

9、：16只雄性SD大鼠只隨機分為2組：①手術(shù)組(n=8只)大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術(shù)臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復(fù)位腎臟，縫合。1周后切除整個右腎，2次切除5/6腎臟。②假手術(shù)對照組(n=8只)僅以水合氯醛注射麻醉后暴露并剝離腎包膜，不做腎切除。于造模后第12周處死大鼠，留取腎組織石蠟切片常規(guī)HE和M

10、asson染色觀察腎臟組織病理改變；腎組織冰凍切片行CD31、α-SMA間接免疫熒光雙染色后應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的情況。
　　 第三部分：32只雄性SD大鼠，隨機分為3組：①治療組12只，大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術(shù)臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復(fù)位腎臟，縫合。1周后切除整

11、個右腎，共切除5/6腎臟；于第2次手術(shù)同時腎靜脈注射裸質(zhì)粒pCMV-NETRIN-1-IRES2-EGFP(100μg，0.2ml)，按文獻(xiàn)方法注射前左腎動、靜脈同時鉗夾，在2秒鐘內(nèi)注射完畢，術(shù)后第12周外死大鼠。②模型組12只，大鼠行10%水合氯醛麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術(shù)臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復(fù)位腎臟，縫合。1周后切除整個右

12、腎，2次切除5/6腎臟；行第2次手術(shù)同時于左腎靜脈注入質(zhì)粒IRES2-EGFP(100μg，0.2ml)，方法同上。③假手術(shù)對照組12只，僅以水合氯醛注射麻醉后暴露并剝離腎包膜，不做腎切除，行第2次手術(shù)同時于左腎動脈注入等量的生鹽水(0.2 ml)。治療組及模型組于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后1、4、8、12周各處死1只大鼠，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。術(shù)后第12周處死大鼠，大鼠在處死前留尿測24小時尿蛋白定量，處死時留取血行腎功檢查。腎標(biāo)本

13、做HE和Masson染色觀察netrin-1治療后腎臟組織形態(tài)學(xué)變化情況。腎組織冰凍切片行CD31、α-SMA間接免疫熒光雙染色后應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的情況。采用免疫組化方法檢測治療前后管周毛細(xì)血管密度的改變；PT-PCR方法檢測治療前后netrin-1、MCP-1、HIF-1α的mRNA表達(dá)變化；Western blot技術(shù)檢測治療前后netrin-1、MCP-1、HIF-1α的蛋白表達(dá)變化。數(shù)據(jù)處理：采用SPS

14、S12.0統(tǒng)計軟件分析處理，計量數(shù)據(jù)X±s，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 第一部分：①一般狀態(tài)觀察：假手術(shù)組表現(xiàn)機警，反應(yīng)快，皮毛致密、整齊而有光澤，生長、進(jìn)食及活動情況均無明顯異常。模型組從術(shù)后4周起出現(xiàn)明顯營養(yǎng)不良，精神萎靡、活動遲緩，食欲不振、皮毛蓬松、枯槁無光澤，體重增長緩慢，第11周時足部出現(xiàn)不同程度水腫，各組大鼠體質(zhì)量隨時間的延長而增加。各組組內(nèi)4、8、12周相比

15、，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與假手術(shù)大鼠體重相比，第8、12周模型組體重明顯減少(P<0.05)。②生化指標(biāo)檢查結(jié)果：模型組第4周開始，BUN和Scr開始升高，與假手術(shù)相比有顯著差異(P<0.01)，第8周和12周呈逐漸升高趨勢，與對照組相比均有顯著性差異(P<0.01)，模型組第4、8、12周，尿蛋白逐漸升高，與假手術(shù)相比，均有顯著性差異(P<0.01)。③大鼠腎臟的病理變化：假手術(shù)組4、8、12周腎小球腎小管基本正常，腎

16、間質(zhì)相對面積分別為0.022±0.004，0.025±0.003，0.028±0.012；模型組第4周出現(xiàn)系膜增生，間質(zhì)內(nèi)見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)相對面積0.123±0.042；模型組第8周腎小球系膜系膜重度增生，細(xì)胞增多，腎小球囊壁增厚、間質(zhì)增寬，纖維組織增多，輕度纖維化，腎間質(zhì)相對面積為0.265±0.065；模型組第12周腎小球球囊粘連，出現(xiàn)局灶性節(jié)段灶硬化的腎小球硬化，腎小管灶狀萎縮和代償性腎間質(zhì)纖維化，腎間質(zhì)相對面積為

17、0.472±0.093。電鏡檢查假手術(shù)組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，模型組逐漸出現(xiàn)線粒體空泡樣變性，基底膜厚薄不均，模糊，局部出現(xiàn)斷裂。④腎臟管周毛細(xì)血管密度的改變：應(yīng)用免疫組織化學(xué)染包CD34蛋白陽性表達(dá)為棕黃色，位于管周毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)，通過CD34計算出PTC密度。假手術(shù)組4、8、12周PTC分別為41.96±5.08/0.13mm2、42.65±6.32/0.13 mm2、43.61±6.94/0.13mm2，模型組分

18、別30.25±5.62/0.13mm2、17.28±3.61/0.13mm2、5.06±1.37/0.13 mm2。⑤大鼠腎臟組織Netrin-1，HIF-1α蛋白表達(dá)定位及蛋白表達(dá)的改變：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示netrin-1蛋白陽性表達(dá)為棕黃色，位于腎小管細(xì)胞的胞漿中。假手術(shù)組腎小管胞漿大量表達(dá)netrin-1，IOD分別為(48.36±12.54)×103、(45.69±10.25)×103、(43.94±11.82)×103。在以

19、后的時間點模型組第4周可見netrin-1表達(dá)減少，IOD值為(31.62±6.51)×103，第8周(18.67±4.02)×103、12周表達(dá)進(jìn)一步減少，IOD值為(6.31±2.01)×103，與假手術(shù)組相比，P值均<0.01。HIF-1α表達(dá)于細(xì)胞核，在假手術(shù)組各時間點，幾乎無表達(dá)。模型組于第8周開始表達(dá)增強，于假手術(shù)相比P值均<0.01。應(yīng)用Western blotting方法表明netrin-1在假手術(shù)組中均為高表達(dá)，而在模

20、型組表達(dá)逐漸下降。HIF-1α蛋白在假手術(shù)組及模型組第4周幾乎無表達(dá)，在模型組第8、12周表達(dá)明顯增加。
　　 第二部分：內(nèi)皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的鑒定①假手術(shù)對照組中CD31于腎小球及腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)廣泛表達(dá)。α-SMA主要在小動脈壁表達(dá)，腎小球和腎小管間質(zhì)偶見陽性表達(dá)。②手術(shù)組CD31于腎小球和腎間質(zhì)毛細(xì)血管中仍表達(dá)，因腎小球硬化及腎間質(zhì)血管減少而表達(dá)減少。α-SMA在手術(shù)組腎小球內(nèi)可見陽性表達(dá)，尤其以腎小球血管極多見，腎

21、小管和間質(zhì)均可以見到大量表達(dá)。⑧CD31和α-SMA共表達(dá)為黃色熒光信號。假手術(shù)組未見。而模型組見部分α-SMA陽性的間質(zhì)細(xì)胞同時表達(dá)CD31，二者共定位的部位呈黃色顆粒。
　　 第三部分：①腎功能測定結(jié)果：模型組BUN、Scr逐漸升高，第12周分別為31.26±7.83 mmol/L、141.8±27.6μmol/L，與假手術(shù)對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.01；治療組BUN、Scr明顯降低為18.14±4.59 mmol/L、

22、114.7±37.2μmol/L，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01，但仍高于假手術(shù)對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.01。②24小時尿蛋白結(jié)果：模型組第12周尿蛋白升高，與假手術(shù)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；治療組24小時尿蛋白升高，與假手術(shù)對照組比較差(P<0.01)；模型組與治療組相比無顯著性差異(P>0.05)。③腎臟病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組損傷嚴(yán)重，腎間質(zhì)纖維化明顯，腎間質(zhì)纖維化面積為0.487±0.140，治療組

23、腎臟損傷減輕，纖維化程度降低，纖維化面積為0.272±0.009，與假手術(shù)對照組和治療組相比，模型組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積明顯增加P<0.01。④內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的鑒定：間接免疫熒光染色共聚焦顯微鏡觀察可見治療組CD31和α-SMA共表達(dá)明顯少于模型組。⑤腎臟管周毛細(xì)血管網(wǎng)的改變：免疫組化染色顯示CD34蛋白陽性表達(dá)為棕黃色，位于管周毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)，通過CD34計算出PTC密度。假手術(shù)組、模型組、治療組的PTC分別為4

24、2.39±4.76/0.13 mm2、4.98±2.01/0.13 mm2、18.31±3.72/0.13 mm2。治療組的PTC明顯高于模型組，但仍低于假手術(shù)組，P均<0.01。⑥腎臟組織Netrin-1、MCP-1、HIF-1α蛋白表達(dá)的改變：治療組Netrin-1陽性表達(dá)較模型組明顯增多，模型組表達(dá)減少，甚至完全缺乏，P<0.01；治療組腎臟MCP-1少量表達(dá)，模型組腎小管腎小球及間質(zhì)MCP-1表達(dá)明顯增強，表達(dá)量高于治療組和假手

25、術(shù)對照組P<0.05。治療組腎臟HIF-1α陽性表達(dá)比模型組明顯減弱，但仍明顯高于正常組P均<0.01。以上指標(biāo)腎臟免疫印跡分析顯示了同樣的變化趨勢。⑦腎臟組織Netrin-1、MCP-1、HIF-1α基因表達(dá)的改變：治療組腎臟Netrin-1的mRNA表達(dá)水平較模型組增加，與模型組相比P<0.01；治療組腎臟MCP-1的mRNA表達(dá)水平較模型組下降，P<0.01；治療組腎臟MCP-1的mRNA表達(dá)水平較模型組下降，P<0.01。

26、>　　 結(jié)論
　　 本研究結(jié)果表明：
　　 (1)Netrin-1在大鼠的腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)，在5/6腎切除的腎組織中netrin-1隨著腎臟纖維化的進(jìn)展逐漸減少。
　　 (2)5/6腎切除大鼠的殘腎組織中PTC密度隨疾病進(jìn)展逐漸減少，在殘腎組織netrin-1表達(dá)下降和PTC的減少成正相關(guān)。netrin-1在殘腎組織中表達(dá)下降，可能是管周毛細(xì)血管網(wǎng)減少的原因之一。
　　 (3)Netrin-1基