UT-B基因轉染對5-6腎切除大鼠腎功能的影響.pdf

1、目的：構建包含大鼠尿素轉運蛋白B（urea transporter B，UT-B）基因的重組腺病毒載體，研究UT-B基因轉染對Caco-2細胞中UT-B mRNA和蛋白的表達及尿素轉運功能的影響；構建大鼠5/6腎切除腎衰模型，研究經(jīng)腸道給予重組腺病毒載體對大鼠結腸組織 UT-B mRNA及蛋白的表達及血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平的影響，為腎功能不全尋找新的基因治療手段。
　　方法：取SD大鼠腎髓質(zhì)

2、，抽提總RNA，逆轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增大鼠UT-B基因的CDS區(qū)全長片段，PCR產(chǎn)物連接至pMD-18T克隆載體，分別以克隆載體pMD18-UT-B和IRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，PCR擴增UT-B和IRES-EGFP序列，通過引物重疊區(qū)進行PCR拼接，并在UT-B-IRES-EGFP兩端引入attB1、attB2重組臂序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)BP重組系統(tǒng)將UT-B-IRES-EGFP融合基因重組到入門載體 pDO

3、NR221中，構建入門克隆。入門克隆與表達載體pAd/CMV/V5-DEST使用 LR重組系統(tǒng)進行體外重組，構建表達克隆pAd-UT-B-IRES-EGFP，pAd-UT-B-IRES-EGFP轉化DH-5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，PCR及測序驗證。pAd-UT-B-IRES-EGFP用 Pac I酶切線性化后由Lipofectamine2000介導轉染293A細胞，包裝病毒，收集病毒液并測定滴度。重組的腺病毒體外感染培養(yǎng)的Caco-

4、2細胞，以含有EGFP但無UT-B的腺病毒空載體為對照，RT-PCR檢測Caco-2細胞中UT-B mRNA的表達，Western blot檢測UT-B蛋白表達，以14C同位素標記法測定Caco-2細胞尿素轉運功能。構建5/6腎切除大鼠腎功能不全動物模型，經(jīng)腸道給予pAd-UT-B-IRES-EGFP載體，以含有EGFP但無UT-B的腺病毒空載體為對照，檢測大鼠腸組織UT-B mRNA和蛋白表達及血BUN水平。
　　結果：成功克隆

5、了大鼠UT-B基因，構建了pAd-UT-B-IRES-EGFP載體，經(jīng)PCR及測序驗證，該表達載體包含UT-B基因，且序列與GeneBank中收錄的大鼠UT-B序列一致。重組的腺病毒感染培養(yǎng)的Caco-2細胞24h后，可檢測到UT-B mRNA及UT-B蛋白的表達明顯增強（P<0.05），同時尿素轉運效率增加（P<0.05）。大鼠5/6腎切除8周后 BUN明顯增高（P<0.01），經(jīng)腸道給予pAd-UT-B-IRES-EGFP載體后，大