YAP在菲小細胞肺癌增殖侵襲中的作用研究.pdf

1、前言：近年來肺癌發(fā)病率持續(xù)升高,在過去的30年中,肺癌所導致的死亡已躍居惡性腫瘤死因的第一位。而80％的肺癌患者死于腫瘤的復發(fā)和轉移,因此尋找調控肺癌侵襲、轉移的關鍵靶點是提高肺癌患者生存率的關鍵。
　　 Yes associated protein(YAP)因其首先被發(fā)現能夠與非受體酪氨酸激酶Yes蛋白結合而得名。最近研究發(fā)現YAP是Hippo信號通路下游的效應分子,而Hippo通路是在進化過程中高度保守的調節(jié)細胞增殖和凋亡的

2、關鍵信號通路。YAP是一個轉錄調節(jié)因子,它可以與具有PPXY結構域的轉錄因子結合,包括ErbB4,P73,TEAD,P53BP-2,Runx2等,調節(jié)一系列與細胞增殖和凋亡相關的因子。在哺乳動物中,Hippo通路可以使YAP磷酸化,從而使其定位于細胞漿中,影響其與轉錄因子的結合進而抑制其功能。在小鼠肝細胞中,YAP能上調Ki-67,c-myc,SOX4及AFP的表達促進細胞增值,并上調BIRC5/survivin的表達抑制細胞凋亡。

3、r>　　 最近研究發(fā)現,YAP在腫瘤發(fā)展過程中具有非常重要的作用。YAP在肝癌,胃癌,結腸癌,乳腺癌,卵巢癌等腫瘤中呈顯著高表達；上調YAP可抑制細胞間的接觸抑制作用；在乳腺上皮細胞MCF10A中上調YAP可促進細胞的上皮間質轉化;在肝臟特異性高表達YAP的轉基因鼠中,YAP可使肝臟體積明顯增大并最終發(fā)展成肝癌。
　　 盡管越來越多的證據表明YAP在腫瘤的發(fā)展中具有重要作用,但是YAP在非小細胞肺癌中的作用還不清楚。本研究目的

4、旨在探討YAP在非小細胞肺癌中的臨床意義和生物學功能。
　　 材料和方法：
　　 1、組織來源
　　 具有完整隨訪資料的92例原發(fā)性非小細胞肺癌及相應正常肺組織標本均來自1995年到2003年在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實行手術的病人,組織經10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋?；颊咝g前均未接受放化療。組織學分類和分化程度根據2004WHO分類標準進行判定,按國際抗癌聯盟的肺癌p-TNM分期標準進行病理分期。
　

5、　 2、免疫組織化學染色將石蠟組織塊切成4μm厚切片,脫蠟,脫水,在PH6檸檬酸鈉緩沖液中高溫高壓修復2分鐘。3％H2O2孵育20分鐘,5％山羊血清孵育30分鐘。抗YAP的多克隆抗體4℃孵育過夜。以PBS代替一抗作為陰性對照。采用Elivision試劑盒檢測抗體結合。DAB顯色,蘇木素復染細胞核,封片。
　　 3、結果判定
　　 YAP免疫組化陽性信號定位于細胞漿與細胞核。我們根據免疫組化染色強度,染色細胞百分比,核漿

6、定位三個方面進行結果統計。我們將無染色的記為陰性。對于漿著色,弱漿著色定為低表達,小于50％的強漿著色定為弱表達,大于50％的強漿著色定為強表達。對于細胞核染色,小于10％的核著色定義為YAP弱表達,大于10％的核著色定義為YAP強表達。
　　 4、細胞培養(yǎng)
　　 肺癌細胞系H157,A549(購自ATCC)均用含10％熱滅活新鮮小牛血清的RPMI1640(Gibco,USA)、100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈

7、霉素的培養(yǎng)基,在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。
　　 5、質粒和細胞轉染pcDNA3.1-hYAP質粒由Subham Basu教授(Cancer Research UK,London,UK)惠贈。pcDNA3.1-hYAP和對照pcDNA3.1質粒用Attractene轉染試劑根據說明進行轉染。mRNA表達水平48小時后通過real-time PCR檢測,蛋白水平72小時后通過western blotting檢測。
　　

8、 6、siRNA干擾On-TargetPlus SMARTpool siRNA for YAP與On-TargetPlus siControl均購自Dharmacon。轉染前24小時將細胞按50％密度接種于24孔板,采用DharmaFECT1轉染試劑進行轉染,轉染后使用PCR和Western blot檢測干擾效率。
　　 7、Real-time RT-PCR對于培養(yǎng)細胞采用Rneasy plus Mini kit from(Q

9、iagen)提取總RNA。采用ABI high capacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)進行反轉錄。PCR采用SYBRGreen染料法,使用AB17900實時定量PCR儀,按照以下程序進行反應:50℃2分鐘,95℃10分鐘,95℃15秒,60℃60秒共40個循環(huán)。為了證明擴增產物的特異性引物都進行了融解曲線分析。Beta-actin作為內參,采用相對定量法進行結果分析,△Ct=Ct基因-Ct內參,

10、基因的相對表達量由2-△△Ct計算。實驗都重復三次,取平均值。
　　 8、Western Blot法檢測蛋白表達收集細胞加入裂解液充分裂解,低溫高速離心4℃,12000轉/min,30min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳(12％SDS-PAGE凝膠)、轉印(50V,120min)、5％正常小牛血清封閉,一抗4℃孵育過夜,分別與對應的二抗室溫孵育2h,ECL顯色,結果經自動電泳凝膠成像分析儀(Chemi Imag

11、er5500,AlphaInnotech,USA)采集,進行灰度值測定。
　　 9、MTT法檢測細胞增殖及集落形成實驗將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200ul含103個細胞,培養(yǎng)24hr,每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4hr,吸去上清液,加入150ulDMSO(Sigma,USA),振蕩10min,490nm波長下測定各孔光吸收值,以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細胞生長曲線。
　　 集落形成實驗在轉染或干

12、擾YAP48小時后接種1000個細胞于6cm培養(yǎng)皿中,2周后用Giemsa染色。
　　 10、細胞遷移和侵襲能力檢測遷移實驗用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞,調至2.5x105個/ml細胞,取100ul加入上室中(孔徑8um,Costar,USA),下室加入600ul含10％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)6hr后吸盡培養(yǎng)基,PBS清洗后,甲醇室溫固定15min,用棉簽輕擦掉上表面的細胞,蘇木素

13、染色,室溫干燥過夜。取下聚碳酸酯微孔膜,置載玻片上,鏡下觀察。細胞侵襲能力的測定用預冷的無血清RPMI1640培養(yǎng)基以1:3稀釋Matrigel(BD Biosciences,USA)加入上室100ul,在室溫下放置3hr。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈,其他與遷移實驗相同,培養(yǎng)18hr后觀察結果。
　　 11、免疫共沉淀收集的新鮮培養(yǎng)的細胞中加入裂解液,充分裂解后,每管分別加入100ul磁珠(Miltenyi Biotec,Ge

14、rmany)和20ulYAP抗體,使終體積為1ml,4℃孵育30min,用蛋白裂解液沖洗u柱(Miltenyi Biotec,Germany),將蛋白樣加入u柱,加入20ul的95℃預熱上樣緩沖液,孵育5min,用50ul的95℃預熱上樣緩沖液沖洗,收集液體,做Western blot,重復三次,取平均值。
　　 12、統計分析采用SPSS13.0(SPSS,Chicago,IL,USA)統計分析軟件,對YAP表達和臨床病理因素

15、的關系用卡方檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法,用Log-rank檢驗判斷差異性;其他實驗結果采用t檢驗進行數據分析,用均值±標準差表示,P＜0.05為差異有意義。
　　 結果：
　　 1、YAP在非小細胞肺癌中過表達我們采用免疫組化的方法檢測了YAP蛋白在92例肺癌及20例癌旁正常肺組織中的表達情況。在92例非小細胞肺癌中YAP陽性表達為61例,陽性率為66％。其中30例為強陽性表達,31例為弱陽性表達。陽性

16、信號主要表達于腫瘤細胞的細胞核中。在20例正常支氣管上皮中YAP在3例中有強表達并且陽性信號定位在Ⅱ型肺泡上皮細胞。
　　 2、YAP在非小細胞肺癌中與臨床病理因素相關對YAP表達與臨床病理因素相關性進行統計分析,我們發(fā)現YAP的陽性表達與年齡、性別、分化、腫瘤大小無顯著關系。YAP蛋白在腺癌中的表達陽性率明顯高于鱗癌,有統計學意義(p=0.0199)。YAP的陽性表達與肺癌患者的淋巴結轉移(p=0.0093),p-TNM分期(

17、p=0.0037)有著顯著關系。分析YAP與生存時間我們發(fā)現YAP表達陽性的患者生存時間明顯小于YAP陰性患者的生存時間(p=0.00472)。COX多因素分析發(fā)現淋巴結轉移是一個獨立的預后因素(表2)。
　　 3、YAP促進肺癌細胞的增殖和侵襲我們使用實時定量PCR篩選了肺癌細胞系中的YAP的表達含量,我們發(fā)現H157細胞中YAP含量較高而A549細胞中YAP含量較低,于是我們在H157細胞中干擾YAP,在A549細胞中轉染Y

18、AP并觀察肺癌細胞增殖的變化。我們首先驗證了干擾和轉染的效率,并使用MTT和集落形成實驗檢測YAP變化對細胞增殖的影響。我們發(fā)現轉染YAP能夠促進肺癌細胞增殖而干擾YAP抑制細胞生長速度。同時我們使用Transwell實驗檢測YAP對肺癌細胞侵襲的作用,我們發(fā)現YAP能夠促進細胞侵襲能力而干擾YAP抑制其侵襲力。
　　 4、YAP并非通過促進肺癌細胞EMT來介導侵襲作用有研究顯示YAP在MCF10A中通過EMT介導細胞侵襲,為了

19、在肺癌細胞中驗證這一現象是否存在,我們使用Realtime-PCR和western blot檢測轉染或干擾YAP后,EMT相關基因的表達改變。我們檢測了E-cadherin、N-Cadherin、Vimentin、TGF-beta1、TGF-beta2的表達,發(fā)現這些指標沒有發(fā)生明顯的變化。此外,我們檢測了侵襲相關蛋白MMP2和MMP9的表達水平,我們發(fā)現轉染或干擾YAP對MMP2的mRNA和蛋白水平沒有顯著影響,此外,干擾YAP輕微下

20、調了MMP9的mRNA和蛋白水平。
　　 5、YAP通過與TEAD結合調控P21和P27作用調節(jié)細胞周期和增殖我們研究發(fā)現,YAP能夠調節(jié)細胞周期,上調YAP可以促進細胞從G1期進入到S期,下調YAP則相反,能夠阻滯細胞于G1期。我們檢測了與細胞周期相關的G1/S期調控元件的表達情況(p21、p27、p53、p16、CyclinE、CyclinD1、CyclinD3、CDK2、CDK4和CDK6),我們發(fā)現上調YAP可以使肺癌A

21、549細胞表達P21和P27 mRNA下降,干擾YAP得到了相反的結果,即P21和P27mRNA表達上調.由于YAP不具有直接調控轉錄的功能,YAP能夠與轉錄因子TEAD1相結合,而轉錄因子TEAD1具有抑制某些基因轉錄的功能,我們推測YAP能夠結合TEAD1從而增強TEAD1對P21和P27的轉錄抑制作用。我們首先使用免疫共沉淀檢測了YAP與TEAD能夠直接作用。使用用YAP抗體沉淀A549細胞總蛋白后我們用TEAD1抗體檢測蛋白發(fā)現

22、52kd處出現條帶,同樣我們使用TEAD1抗體沉淀A549蛋白并用YAP抗體檢測在75kd得到蛋白條帶。以上結果證明YAP能夠與TEAD1直接結合。為了驗證YAP依賴TEAD1調控P21和P27轉錄,我們首先在A549細胞中干擾TEAD1的表達水平,我們發(fā)現在干擾TEAD1之后,P21和P27的mRNA水平出現了上調,這提示TEAD1能夠抑制P21和P27的轉錄。然后我們使用干擾TEAD1的A549細胞系轉染或干擾YAP觀察P21和P2

23、7轉錄的變化。我們發(fā)現在干擾了內源性TEAD1的A549細胞系中,轉染YAP并不能明顯下調P21和P27的mRNA含量,同樣在干擾了TEAD1的A549中繼續(xù)干擾YAP只能夠輕微上調P21和P27的含量。以上結果證明了YAP對P21和P27的調控作用是依賴于TEAD1而存在的。
　　 6、YAP通過與TEAD1結合調控TIMP1的表達從而調控肺癌細胞侵襲能力對侵襲相關蛋白MMP系列蛋白MMP1/2/3/7/9使用PCR進行檢測后

24、我們發(fā)現轉染和干擾YAP后MMP的轉錄水平未見明顯變化。使用Western Blot檢測轉染和干擾YAP后MMP2、9蛋白水平我們發(fā)現干擾YAP輕微下調了MMP9的蛋白含量我們采用明膠酶譜法檢測了活性MMP2,9和總MMP2,9的含量,我們發(fā)現轉染YAP后,總MMP2和9的變化不明顯,但是活性MMP9的含量有一定程度的上升。以上結果提示YAP能夠促進MMP9的活化,TIMP1是MMP9活化的重要抑制因子。我們檢測了轉染YAP之后MMP抑

25、制蛋白TIMP1的變化,發(fā)現轉染YAP后TIMP1的含量明顯下調。因此YAP可以通過調控TIMP1轉錄從而調節(jié)MMP9的活化水平。從而促進細胞侵襲能力。
　　 討論：
　　 YAP在許多腫瘤中存在過表達,其與腫瘤發(fā)生進展的關系越來越被關注。但是在肺癌中關于YAP的研究非常有限。在本研究中,我們證實了YAP在非小細胞肺癌中過表達,其過表達與肺癌的pTNM分期和淋巴結轉移相關,并且能夠提示肺癌患者的不良預后。此外,YAP能夠

26、促進肺癌細胞的增殖和侵襲能力。
　　 之前有研究發(fā)現,YAP在肝癌,前列腺癌,結腸癌和乳腺癌中的表達升高并定位于細胞核。Steinhardt等使用組織芯片用組化研究發(fā)現YAP在54％的非小細胞肺癌中過表達。在177例肝癌的臨床研究中發(fā)現YAP與低度組織分化,血清AFP水平和腫瘤復發(fā)成正相關,并且是患者生存預后的獨立影響因素。與先前的研究相似,我們發(fā)現YAP在非小細胞肺癌中過表達,并且主要定位于細胞核。我們發(fā)現YAP的陽性表達與年

27、齡、性別、分化、腫瘤大小無顯著關系。YAP蛋白在腺癌中的表達陽性率明顯高于鱗癌(p=0.0199)。YAP的陽性表達與肺癌患者的淋巴結轉移(p=0.0093),p-TNM分期(p=0.0037)有著顯著關系。分析YAP與生存時間我們發(fā)現YAP表達陽性的患者生存時間明顯小于YAP陰性患者的生存時間(p=0.00472)。
　　 作為一個潛在的腫瘤基因,YAP能夠調控細胞增殖速度,在肝細胞中過表達YAP能夠顯著增加肝臟腫瘤并最終導致

28、肝癌發(fā)生。YAP能夠減弱細胞之間的接觸抑制并增強細胞增殖速度。為了研究YAP對肺癌細胞增殖的影響,我們在肺癌細胞系中干擾轉染YAP,我們發(fā)現轉染YAP能夠顯著促進細胞增殖速度,干擾YAP能夠抑制細胞增殖速度,此外,轉染YAP后的肺癌細胞系A549達到細胞融合后仍然繼續(xù)生長,其飽和密度大于為未轉染YAP的細胞。
　　 YAP是如何促進細胞增殖速度的呢,我們采用流式細胞周期檢測發(fā)現YAP能夠促進細胞進入S期,干擾YAP能夠阻滯細胞在

29、G1期。我們使用PCR對于G1/S期調控相關蛋白進行檢測發(fā)現轉染YAP之后P21和P27表達下降,而干擾YAP之后P21和P27表達上升。P21和P27能夠阻滯細胞于G1期的功能,在腫瘤細胞的增殖調控中有重要功能。因此我們認為在肺癌細胞中YAP通過對P21,P27的調節(jié)來控制腫瘤增殖。由于YAP不具有直接調控轉錄的功能,YAP能夠與轉錄因子TEAD1相結合,而轉錄因子FEAD1具有抑制某些基因轉錄的功能,我們推測YAP能夠結合TEAD1

30、從而增強TEAD1對P21和P27的轉錄抑制作用。我們使用免疫共沉淀檢測了YAP與TEAD能夠直接作用。為了驗證YAP依賴TEAD1調控P21和P27轉錄,我們首先在A549細胞中干擾TEAD1的表達水平,我們發(fā)現在干擾TEAD1之后,P21和P27的mRNA水平出現了上調,這提示TEAD1能夠抑制P21和P27的轉錄。然后我們使用干擾TEAD1的A549細胞系轉染或干擾YAP觀察P21和P27轉錄的變化。我們發(fā)現在干擾了內源性TEAD

31、1的A549細胞系中,轉染YAP并不能明顯下調P21和P27的mRNA含量,同樣在干擾了TEAD1的A549中繼續(xù)干擾YAP只能夠輕微上調P21和P27的含量。以上結果證明了YAP對P21和P27的調控作用是依賴于TEAD1而存在的。
　　 除了YAP對增殖的影響之外,我們還發(fā)現了YAP對肺癌侵襲能力的促進作用。由于先前YAP促進EMT的報道,我們首先檢測了EMT相關基因的變化。然而,我們發(fā)現在肺癌細胞系中。YAP并不能調控Ec

32、adherin,Ncadherin,Vimentin等EMT基因。此外,我們檢測了與侵襲關系密切的MMP2和9的基因蛋白水平,我們采用明膠酶譜發(fā)現了MMP9的活性蛋白水平在轉染YAP后升高,MMP9的蛋白在干擾YAP后有輕微下調,這提示YAP可能調控MMP9活性,進一步檢測MMP抑制物發(fā)現轉染YAP下調了MMP9抑制蛋白TIMP1。因此YAP可能是通過下調TIMP1,從而增加MMP9活性,促進細胞侵襲能力。我們猜測YAP可能通過與TEA

33、D1相結合從而抑制TIMP1轉錄,在干擾TEAD1后,我們在A549中轉染YAP,發(fā)現轉染YAP和未轉染YAP的細胞TIMP1的區(qū)別不明顯,YAP只是輕微下調了。TIMP1mRNA。以上結果提示YAP對TIMP1的調控作用同樣依賴其與TEAD1的相互作用。綜上所述,YAP在肺癌中過表達,對肺癌增殖和侵襲具有重要的調控作用,可能成為肺癌診斷和治療的新靶點。
　　 結論：
　　 1、YAP在非小細胞肺癌組織中高表達,并且核表