LncRNA HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的關(guān)系及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究及初步探討HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的關(guān)系及其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　（1）選取乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3-TS，通過間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)建立曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞系SK-BR-3-TR。
　　（2） qRT-PCR檢測(cè)SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)，MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞模型腫瘤細(xì)胞的增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，transwell

2、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力，qRT-PCR和western blot分別檢測(cè)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition, EMT）相關(guān)基因和蛋白TGF-β、Snail、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)以及PI3K/AKT/mTOR和MEK/MAPK信號(hào)通路活性。
　?。?）甲基化特異性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）檢測(cè)兩種細(xì)胞TGF-β、PTE

3、N及CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平。
　?。?）慢病毒轉(zhuǎn)染siRNA干擾實(shí)驗(yàn)阻抑SK-BR-3-TR細(xì)胞HOTAIR表達(dá)，反向驗(yàn)證HOTAIR與曲妥珠單抗耐藥的關(guān)系及其分子機(jī)制。
　?。?） BALB/c裸鼠荷瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分別建立SK-BR-3-TS、SK-BR-3-TR和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR裸鼠荷瘤模型，觀察三種模型瘤體生長速度；免疫組化技術(shù)檢測(cè)瘤體TGF-β、Snail和E-cadheri

4、n以及PTEN、Ki67的表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證HOTAIR對(duì)曲妥珠單抗耐藥的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）在成功誘導(dǎo)及穩(wěn)定培養(yǎng)乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞系SK-BR-3-TR中，與曲妥珠單抗敏感細(xì)胞株SK-BR-3-TS相比，HOTAIR RNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（2.216±0.332 v0.326±0.05，P=0.0006）。
　?。?） MTT法、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，與敏感細(xì)

5、胞相比，耐藥細(xì)胞增殖活性及侵襲能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少。
　?。?） qRT-PCR及WB檢測(cè)顯示，與敏感細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞EMT相關(guān)基因TGF-β、Snail及Vimentin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，HER2受體信號(hào)通路中HER2、PI3K、AKT、mTOR及MAPK基因表達(dá)水平及HER2受體磷酸化水平無明顯變化，但p-AKT、p-MAPK及CyclinD1水平升高，而PTEN、P27水平下調(diào)。
　　（4）

6、MSP檢測(cè)耐藥細(xì)胞PTEN基因甲基化水平升高，TGF-β基因甲基化水平下調(diào)，而CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平未發(fā)生明顯變化。
　?。?）慢病毒介導(dǎo)RNA干擾實(shí)驗(yàn)阻抑耐藥細(xì)胞HOTAIR表達(dá)后，HOTAIR表達(dá)明顯下調(diào)。MTT法檢測(cè)siHOTAIR-SK-BR-3-TR細(xì)胞恢復(fù)了對(duì)曲妥珠單抗的敏感性，細(xì)胞增殖活性及侵襲能力減弱，細(xì)胞凋亡比例增加，qRT-PCR及WB檢測(cè)細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白TGF-β、Snail及Vimen

7、tin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，HER2受體信號(hào)通路中HER2、PI3K、AKT、mTOR及MAPK表達(dá)水平及HER2磷酸化水平未發(fā)生明顯改變，但p-AKT、p-MAPK及CyclinD1水平下調(diào)，而PTEN、P27水平上調(diào)。
　?。?） MSP檢測(cè)siHOTAIR-SK-BR-3-TR細(xì)胞PTEN基因甲基化水平下調(diào)，TGF-β基因甲基化水平上調(diào)，而CNK1B(P27kip1)基因甲基化水平無顯著差異。
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8、7）成功建立SK-BR-3-TS、SK-BR-3-TR和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR裸鼠荷瘤模型。SK-BR-3-TR荷瘤模型瘤體生長速度較SK-BR-3-TS和si-HOTAIR-SK-BR-3-TR模型明顯增快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。si-HOTAIR-SK-BR-3-TR模型瘤體TGF-β和Snail蛋白陽性表達(dá)率（1/6，16.7％；2/6，33.3%）低于SK-BR-3-TR（4/6，66.7%；5/

9、6，83.3%），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Chi-Square tests，F(xiàn)isher’s Exact Test，P=0.242）；E-cadherin及PTEN蛋白陽性表達(dá)率較高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.242）。Ki67的表達(dá)陽性率無差別(均為5/6，83.3%，P=1.000)。
　　結(jié)論：
　　曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞株SK-BR-3-TR中HOTAIR表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)的TGF-β及PTEN基因去甲基化表觀遺傳修飾，從而分別導(dǎo)致