人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)及向感覺神經元誘導研究.pdf

1、第一章人骨髓間充質干細胞體外分離培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　建立本實驗室穩(wěn)定分離擴增hBMSCs的方案并評估獲取的細胞是否為hBMSCs，為后續(xù)實驗奠定基礎。
　　方法:
　　采用直接貼壁法和密度梯度離心法同時分離hBMSCs，比較原代培養(yǎng)過程中集落出現(xiàn)時間、集落數目、P3代細胞生長曲線;利用流式細胞術檢測P3代細胞表面抗原CD34、CD44、CD45的表達情況;成骨、成脂誘導液誘導所獲得細胞向成骨細胞、脂肪細胞

2、分化，以茜素紅及油紅O染色法鑒定成骨分化中鈣結節(jié)及成脂分化中脂滴的形成。
　　結果:
　　直接貼壁法和密度梯度離心法均能分離得到hBMSCs。直接貼壁法集落出現(xiàn)時間較密度梯度離心法短，集落數目多于密度梯度離心法，細胞增殖能力強于密度梯度離心法;流式細胞術檢測直接貼壁法獲得的P3代細胞CD34陽性率2.18％，CD44陽性率98.14％，CD45陽性率0.41％。成骨誘導后以茜素紅染色可見鈣結節(jié)，成脂誘導后油紅O染色可見脂滴形

3、成。
　　結論:
　　1、直接貼壁法和密度梯度離心法均能分離得到hBMSCs;
　　2、綜合比較集落出現(xiàn)時間、集落數目、細胞增殖能力，直接貼壁法優(yōu)于密度梯度離心法;
　　3、經鑒定分離得到的為hBMSCs，為后續(xù)實驗提供了穩(wěn)定的細胞來源。
　　第二章人骨髓間充質干細胞體外誘導向感覺神經元樣細胞分化可行性探討
　　目的:
　　探討人骨髓間充質干細胞向感覺神經元誘導的可能性。
　　方法:

4、>　　RT-PCR檢測RA、Shh、Wnt信號通路相關RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在獲得的hBMSCs中表達情況;
　　使用RA、Shh、Wnt1、RA+Shh、RA+Wnt1、Shh+Wnt1、RA+Shh+Wnt1共7組進行感覺神經元誘導，觀察誘導后細胞形態(tài)改變，熒光定量PCR檢測神經元相關基因β-tubulin3、MAP-2

5、、Tau、GATA-3、Calretinin、Brn3a在各誘導組及hBMSCs中表達情況，免疫熒光檢測誘導后感覺神經元相關標志GATA-3、Calretinin、Brn3a在各誘導組中表達情況，比較各組之間差異。
　　結果:
　　RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在hBMSCs中存在不同程度表達;各誘導組中均可獲得神經元樣細胞，

6、免疫熒光顯示RA+Shh組、RA+Shh+Wnt1組中可見GATA3、Calretinin陽性細胞，Wnt1組、RA+Wnt1組、Shh+Wnt1組、RA+Shh+Wnt1組中可Brn3a陽性細胞;熒光定量PCR結果示β-tubulin3、MAP-2、Tau在各誘導組中均較未誘導組表達上調，有顯著性差異，各誘導組之間相對表達量無明顯差別。GATA3在RA+Shh組、RA+Shh+Wnt1組中較未誘導組增高倍數較大，分別為24.4倍、68

7、.1倍，兩組與未誘導組具有統(tǒng)計學差異，RA+Shh+Wnt1組與RA+Shh組相比具有統(tǒng)計學差異。Calretinin在RA+Shh組、RA+Shh+Wnt1組中較未誘導組增高倍數較大，分別為339.2倍、572.9倍，兩組與未誘導組具有統(tǒng)計學差異，RA+Shh+Wnt1組與RA+Shh組相比具有統(tǒng)計學差異。Brn3a在Wnt1、RA+Wnt1、Shh+Wnt1、RA+Shh+Wnt1組較未誘導組均有顯著性差異，分別增高143.0倍、9

8、4.2倍、132.3倍、424.3倍。
　　結論:
　　1、培養(yǎng)的hBMSCs中存在RA、Shh、Wnt作用基礎;
　　2、Shh和RA單獨誘導hBMSCs無法獲得GATA3、Calretinin陽性表達神經元樣細胞，Shh和RA聯(lián)合誘導hBMSCs可獲得GATA3、Calretinin陽性表達神經元樣細胞，但不能獲得Brn3a陽性細胞。Wnt1單獨誘導hBMSCs可獲得Brn3a陽性表達神經元樣細胞。RA+Shh+W