骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向腸神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung's disease，HD)是小兒消化道常見畸形，發(fā)病率為1/2000～1/5000，其疾病的發(fā)生目前一致認(rèn)為是由于多種原因使胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞在消化道移行受阻，直腸、結(jié)腸甚至小腸腸壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，病變腸管痙攣收縮，腸內(nèi)容物排出受阻，近端腸管繼發(fā)性擴(kuò)張形成巨結(jié)腸。迄今，手術(shù)仍然是最有效的治療手段，雖然，手術(shù)方式的不斷改進(jìn)，微創(chuàng)手術(shù)的日益進(jìn)步，但術(shù)后并發(fā)癥仍困擾著患者和醫(yī)護(hù)工作者。而近年來研究的熱點(diǎn)之

2、一細(xì)胞移植有望成為治療HD又一有效并且安全的方法，本課題將研究如何獲得具有功能的細(xì)胞進(jìn)行移植。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)在體外容易分離、培養(yǎng)及純化，多向分化潛能是其最主要的生物學(xué)特征之一，現(xiàn)在關(guān)于BMSC向神經(jīng)方向分化的研究報道較多，許多研究表明BMSC在體外一定條件下可分化為神經(jīng)細(xì)胞，移植于損傷腦或脊髓治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，這為BMSC治療腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了理論依

3、據(jù)，并避免了神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞移植來源不足及倫理問題。目前BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的具體機(jī)制尚不清楚，可能與誘導(dǎo)劑的共同作用啟動了向神經(jīng)細(xì)胞定向分化有關(guān)的基因表達(dá)或使其表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。較常見的是用β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，BME)、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)及維甲酸等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)，也有用某些生長因子進(jìn)行誘導(dǎo)的。神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用也已受到重視，一方面，神經(jīng)營養(yǎng)因子可在一定培養(yǎng)條件

4、下誘導(dǎo)BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化；另一方面，神經(jīng)營養(yǎng)因子具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)突起生長的作用，缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子的支持可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)先從探討B(tài)MSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的條件，以及有關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的變化，如膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF，RET(rearranged during transfection)等開始，初步探

5、討了其分化的機(jī)制，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)可促進(jìn)BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化，在向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中，GDNF表達(dá)增強(qiáng)，并且RET基因也有表達(dá)，GDNF可能在BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中起到重要作用。在BMSC向腸神經(jīng)元分化的可行性實(shí)驗(yàn)研究中，將GDNF作為誘導(dǎo)因子與胎腸培養(yǎng)基共同作用，誘

6、導(dǎo)BMSC分化為腸神經(jīng)元，誘導(dǎo)后的細(xì)胞，不僅表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)特異性烯醇化酶(neural specific enolase，NSE)以及腸神經(jīng)標(biāo)志物一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，nNOS)，而且還能分泌腸神經(jīng)遞質(zhì)腸道血管活性肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)，說明體外分化的腸神經(jīng)元不僅具備形態(tài)學(xué)上的特征，而且具有一定程度的功能。為了提高BMSC向腸神經(jīng)元的分化率，本實(shí)

7、驗(yàn)還進(jìn)行了GDNF基因轉(zhuǎn)入BMSC的研究，結(jié)果顯示，體外可成功構(gòu)建表達(dá)GDNF的轉(zhuǎn)基因BMSC，在FGCM的誘導(dǎo)下可分化為具有腸神經(jīng)元表型的細(xì)胞，并且誘導(dǎo)分化率高于外源性GDNF組。
　　 但關(guān)于誘導(dǎo)后的腸神經(jīng)元是否具備正常腸神經(jīng)元的功能，移植于無神經(jīng)節(jié)段后能否改善腸段的功能，還有待下一步的在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
　　 第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定
　　 目的：體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干

8、細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)，并進(jìn)行純化和鑒定。
　　 方法：收集Sprague-Dawley(SD)大鼠的股骨骨髓，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基直接種植于培養(yǎng)瓶，反復(fù)傳代貼壁法純化細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD90及CD45。
　　 結(jié)果：BMSC能在體外貼壁生長，經(jīng)過反復(fù)貼壁，BMSC可融合生長，高表達(dá)BMSC標(biāo)志物CD90(93.4%)，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45。<

9、br>　　 結(jié)論：體外可成功培養(yǎng)BMSC，經(jīng)過反復(fù)貼壁法可純化BMSC，可獲得高純度的細(xì)胞。
　　 第二部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
　　 目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)向神經(jīng)分化的條件，了解神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況及膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDN

10、F)的表達(dá)變化。
　　 方法：體外培養(yǎng)大鼠BMSC，至少傳至第4代，進(jìn)行誘導(dǎo)分化。以10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)或/和10ng/ml表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)在含10%胎牛血清的DMEM中誘導(dǎo)，7d后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，免疫組化檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic prot

11、ein，GFAP）及神經(jīng)特異性烯醇化酶（neural specific enolase，NSE）的情況。RT-PCR檢測GDNF及其受體RET mRNA的變化。
　　 結(jié)果：誘導(dǎo)7天后，實(shí)驗(yàn)組均可見GFAP及NSE的表達(dá)，而對照組為陰性。各實(shí)驗(yàn)組比較，bFGF組及bFGF+EGF組表達(dá)的NSE高于EGF組，而EGF組表達(dá)GFAP更高。RT-PCR檢測示，BMSC向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)后，GDNF表達(dá)顯著增強(qiáng)，RET基因也開始表達(dá)，以bF

12、GF+EGF組最明顯。
　　 結(jié)論：bFGF及EGF可促進(jìn)BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化。在向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中，能促進(jìn)GDNF表達(dá)的增強(qiáng)，以及RET基因的表達(dá)，GDNF可能在BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中起到重要作用。
　　 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外兩種方法向腸神經(jīng)元誘導(dǎo)分化及比較
　　 目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)向腸神經(jīng)分化的條件及可行性，

13、并比較兩種方法的分化效率。
　　 方法：體外培養(yǎng)大鼠BMSC，傳至第4代后，進(jìn)行誘導(dǎo)分化。第一種方法：以10ng/ml膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)及10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的稀釋胎腸培養(yǎng)基(fetal gut condition medium，F(xiàn)GCM)誘導(dǎo)7天，免疫組化的方法進(jìn)行鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞的神經(jīng)

14、特異性烯醇化酶（neural specific enolase，NSE）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）及神經(jīng)元一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）的表達(dá)。第二種方法：提取新生大鼠腸組織mRNA，用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法擴(kuò)增GDNF全長cDNA，構(gòu)建其真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP-GDNF，酶切及測序鑒定，然后轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠BMSC

15、，熒光免疫細(xì)胞化學(xué)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測GDNF的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在稀釋的FGCM條件下誘導(dǎo)分化。同樣的方法檢測VIP，nNOS。
　　 結(jié)果：BMSC誘導(dǎo)7天后，兩組實(shí)驗(yàn)組均可見NSE、VIP及nNOS的表達(dá)，而對照組為陰性。表達(dá)GDNF的BMSC被誘導(dǎo)分化的腸神經(jīng)元NSE陽性，VIP及nNOS陽性率高于外源性GDNF誘導(dǎo)的細(xì)胞。
　　 結(jié)論：GDNF聯(lián)合FGCM可誘導(dǎo)BMSC分化為腸神經(jīng)元。表達(dá)GDNF的BMSC分化為腸

16、神經(jīng)元的效率更高。
　　 第四部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腸神經(jīng)元分化后神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的變化及其機(jī)制的初步探討
　　 目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)向腸神經(jīng)分化過程中膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）及其受體RET以及c-kit基因表達(dá)的變化，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。<

17、br>　　 方法：同樣的方法誘導(dǎo)BMSC為腸神經(jīng)元，免疫組化的方法進(jìn)行鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞的神經(jīng)特異性烯醇化酶（neural specific enolase，NSE）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，nNOS）的表達(dá)。RT-PCR檢測GDNF、RET及 c-kit mRNA的變化，Western Blot方法檢測GDNF蛋白的表達(dá)情

18、況。
　　 結(jié)果：BMSC向腸神經(jīng)元誘導(dǎo)后，免疫組化染色NSE，VIP及nNOS陽性，RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前低表達(dá)GDNF以及不表達(dá)RET、C-kit,誘導(dǎo)后GDNF表達(dá)顯著增強(qiáng)，RET、c-kit基因表達(dá)，而且GDNF在蛋白水平上也有表達(dá)。
　　 結(jié)論：GDNF聯(lián)合FGCM可誘導(dǎo)BMSC分化為腸神經(jīng)元，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)腸神經(jīng)元標(biāo)志物，其GDNF、RET及c-kit基因表達(dá)增強(qiáng)；GDNF-RET信號通路在誘導(dǎo)分化過