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文檔簡介
1、目的:本文通過對孫絡(luò)絀急、疏失、瘀阻、滋生相對應(yīng)的微血管痙攣、缺血、栓塞、新生的大鼠腸系膜微血管模型的微觀可視化研究,探尋四種孫絡(luò)病變的中醫(yī)微觀病理特征;并通過腸組織缺血再灌注損傷模型及腸組織血管新生模型,研究內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮屏障、肥大細(xì)胞、炎癥反應(yīng)在腸組織缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制;同時研究通絡(luò)中藥通心絡(luò)對孫絡(luò)病變及腸組織病變的干預(yù)作用。
方法:孫絡(luò)四個病變模型制作:(1)采用腸系膜表面局部滴加去甲腎上腺素的方法制作大鼠腸系膜
2、微血管痙攣模型;(2)采用腸系膜上動靜脈缺血30分鐘再灌注60分鐘的方法制作大鼠腸系膜微血管缺血模型;(3)采用大鼠尾靜脈注射光敏劑血卟啉單甲醚后立即激光照射腸系膜微血管的方法制作微血管栓塞模型;(4)采用腸系膜上動靜脈缺血30分鐘后恢復(fù)再灌注7天的方法制作大鼠腸系膜微血管新生模型。腸組織損傷兩個模型制作:(1)采用夾閉腸系膜上動靜脈30min后恢復(fù)再灌60min方法制作腸組織缺血模型,并于再灌注60min時取材檢測;(2)采用夾閉腸系
3、膜上動靜脈30min后恢復(fù)再灌3d、7d方法制作腸組織血管新生模型,并于再灌注3d和7d分別取材檢測。四種孫絡(luò)病變研究及腸組織缺血研究的分組設(shè)計相同,均為50只大鼠隨機(jī)均分為五組,即空白組、模型組、通心絡(luò)低劑量組、通心絡(luò)中劑量組、通心絡(luò)高劑量組。腸組織血管新生研究應(yīng)用100只大鼠隨機(jī)均分為五組,即空白組、實驗組、通心絡(luò)低劑量組、通心絡(luò)中劑量組、通心絡(luò)高劑量組。通心絡(luò)低、中、高劑量組分別應(yīng)用400、800、1600mg/kg/d的通心絡(luò)超
4、微粉灌胃給藥,空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃,孫絡(luò)絀急、疏失、瘀阻研究及腸組織缺血研究的大鼠在造模前連續(xù)灌胃7天,孫絡(luò)滋生研究造模后連續(xù)灌胃7天,腸組織血管新生研究大鼠于造模后連續(xù)灌胃3或7天。孫絡(luò)病變檢測方法:應(yīng)用正立共聚焦顯微鏡觀察并測量腸系膜微血管的變化情況,孫絡(luò)絀急、疏失、瘀阻、滋生研究均于造模前記錄大鼠腸系膜微血管基礎(chǔ)狀態(tài),孫絡(luò)絀急、疏失、瘀阻實驗于造模后立即記錄微血管的病理變化,孫絡(luò)滋生實驗于造模后第7天記錄微血管新生的病
5、理變化。檢測指標(biāo):(1)孫絡(luò)絀急比較造模前后絀急時間、微血管管徑、血流速度及肥大細(xì)胞脫顆粒情況的變化;(2)孫絡(luò)疏失比較造模前后微血管血流狀態(tài)、側(cè)枝數(shù)目、側(cè)枝長度和出血情況的變化;(3)孫絡(luò)瘀阻記錄微動脈內(nèi)出現(xiàn)血小板黏附及血栓阻塞微動脈的時間、停止照射后微動脈血流再通情況,以及照射后5min、10min、15min、20min和停止照射后5min、10min、15min時的血栓面積;(4)孫絡(luò)滋生比較造模前與造模7天后微血管管徑及側(cè)枝數(shù)
6、量、長度的變化。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件測量并計算相關(guān)數(shù)據(jù)。腸組織損傷檢測方法:究,采用CD31+TUNEL免疫熒光雙染方法測定腸組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況,通過免疫組化方法測定VE-Cadherin、ANGPTL4、HMGB1和NF-κB在腸組織中的表達(dá)情況;(2)腸組織血管新生研究采用c-Fos+Trytase免疫熒光雙染方法測定腸組織肥大細(xì)胞活化情況,通過免疫組化方法測定PECAM-1、NF-κB p65、TNF
7、-α、VE-Cadherin在腸組織中的表達(dá)情況,通過RT-PCR方法測定腸組織中TLR4、ANGPTL-1、miR126基因表達(dá)的情況。
結(jié)果:孫絡(luò)病變實驗結(jié)果:急研究顯示造模后微動脈迅速收縮、痙攣,表現(xiàn)為微血管管徑逐漸縮窄至管腔閉塞、微血管內(nèi)血流停止,隨后逐漸恢復(fù)正常,同時伴有明顯的肥大細(xì)胞脫顆?,F(xiàn)象,空白組未發(fā)生微血管收縮、痙攣的改變;通心絡(luò)預(yù)給藥減少了微動脈痙攣的時間、抑制微動脈管徑縮小、縮短了痙攣過程、同時抑制痙攣引
8、起的肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng),結(jié)果與模型組比較均差異明顯(P<0.05)。(2)孫絡(luò)疏失研究顯示空白組微血管無顯著異常改變,而模型組微血管側(cè)枝數(shù)量減少、側(cè)枝長度減少,并出現(xiàn)出血情況,伴有微血管內(nèi)血流速度減慢,結(jié)果與空白組比較均差異明顯(P<0.05);通心絡(luò)預(yù)給藥顯著抑制微血管側(cè)枝數(shù)量、長度的減少以及出血趨勢,同時促進(jìn)微血管內(nèi)血液正常流動,結(jié)果與模型組比較差異明顯(P<0.05)。(3)孫絡(luò)瘀阻研究顯示空白組微動脈無顯著異常改變,模型組微動脈
9、內(nèi)出現(xiàn)血小板滾動、黏附,并逐漸形成血栓阻塞微動脈,停止照射后血栓并未消散,血小板黏附時間、血栓阻塞微動脈時間、停照后血流恢復(fù)情況及各時間點血栓面積的結(jié)果與空白組比較均差異明顯(P<0.05);通心絡(luò)預(yù)給藥組顯著延長血小板黏附和血栓阻塞微動脈的時間,減少血栓面積,并促進(jìn)栓塞后微動脈血流的再通,結(jié)果與模型組比較差異明顯(P<0.05);(4)孫絡(luò)滋生研究顯示空白組微血管正常生長,包括主干的增粗和側(cè)枝的生長,模型組Ⅰ/R區(qū)和非Ⅰ/R區(qū)的微血管
10、較空白組管徑異常增粗、側(cè)枝數(shù)量及長度異常減少(P<0.05),通心絡(luò)治療可以顯著抑制造模后微血管管徑異常增粗、促進(jìn)側(cè)枝數(shù)量及長度正常生長(P<0.05)。腸組織損傷實驗結(jié)果:(1)腸組織缺血研究顯示,模型組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于空白組(P<0.05),通心絡(luò)低、中、高劑量組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著低于模型組(P<0.05),且通心絡(luò)高劑量組與空白組比較內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)無明顯差別(P>0.05);模型組VE-Cadherin及ANGPT
11、L4的表達(dá)較空白組僅稍有增高或不增高,通心絡(luò)低、中、高劑量組較模型組比較可以顯著促進(jìn)VE-Cadherin及ANGPTL4蛋白的表達(dá)(P<0.05);模型組HMGB1和NF-κB的表達(dá)較空白組明顯增高(P<0.05),通心絡(luò)低、中、高劑量組較模型組比較可以顯著抑制HMGB1和NF-κB蛋白的表達(dá)(P<0.05)。(2)腸組織血管新生研究顯示,Ⅱ/R后3天和7天,模型組炎癥反應(yīng)相關(guān)的肥大細(xì)胞活化水平、TLR4mRNA、TNF-α、NF-κ
12、B的表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),且TLR4mRNA、TNF-α、NF-1B在Ⅱ/R后7天較Ⅱ/R后3天表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05);模型組黏附分子PECAM-1表達(dá)升高(P<0.05),緊密連接蛋白VE-cadherin表達(dá)降低(P<0.05),VE-cadherin在Ⅱ/R后7天較Ⅱ/R后3天表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05);模型組ANGPTL4表達(dá)降低(P<0.05),miR126表達(dá)升高(P<0.05)。通心絡(luò)低、中、高劑量
13、組可以顯著降低Ⅱ/R后3天和7天炎癥相關(guān)肥大細(xì)胞活化水平、TLR4mRNA、TNF-α及NF-κB的表達(dá)量、降低黏附分子PECAM-1的表達(dá)、升高緊密連接蛋白VE-cadherin和血管保護(hù)蛋白ANGPTL4的表達(dá)(P<0.05)。
結(jié)論:孫絡(luò)病變研究結(jié)論:(1)孫絡(luò)絀急以孫絡(luò)持續(xù)收縮、攣急為特征,伴有孫絡(luò)運行氣血功能的缺失;(2)孫絡(luò)疏失以孫絡(luò)數(shù)目的減少、孫絡(luò)運行氣血功能喪失為特征,伴有氣血溢出孫絡(luò)外的表現(xiàn);(3)孫絡(luò)瘀阻以
14、孫絡(luò)內(nèi)氣血瘀滯逐漸形成壞血、死血阻塞孫絡(luò)為特征,伴有孫絡(luò)功能的缺失;(4)孫絡(luò)滋生以孫絡(luò)主干異常增粗、側(cè)枝異常減少為特征,伴有無序無功能孫絡(luò)的異常增多。通心絡(luò)預(yù)給藥或治療可以一定程度的緩解或抑制孫絡(luò)病變的病理過程、促進(jìn)孫絡(luò)損傷的恢復(fù)。腸組織損傷研究結(jié)論:(1)腸組織缺血存在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮屏障損傷和嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的病理變化,通心絡(luò)預(yù)給藥可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、保護(hù)內(nèi)皮屏障并減輕炎癥反應(yīng)。(2)腸組織血管新生存在以肥大細(xì)胞活化、TLR4-N
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