Endosialin-TEM1(CD248)ELISA檢測方法的建立.pdf

1、碩士學(xué)位論文 E n d o s i a l i n ／T E M 1 ( C D 2 4 8 ) E L I S A 檢測方法 的建立 【背景】 碩士研究生：張雯佳 指導(dǎo)教師：袁小澎 摘要 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)不同的組織細(xì)胞來源，將之分為癌癥 ( c a r c i n o m a ) 和肉瘤( s a r c o m a ) 兩種，起源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤稱為癌 癥，起源于間葉組織的惡性腫瘤稱為肉瘤。肉瘤類型眾多，世界衛(wèi)生

2、組織 ( W H O ) 對其的分類多于一百種，最常見的肉瘤類型為脂肪肉瘤和平滑肌肉 瘤。大多數(shù)肉瘤類型好發(fā)于5 5 周歲以上的成年人，如平滑肌肉瘤、惡性纖維 組織肉瘤、滑膜肉瘤和脂肪肉瘤。少數(shù)肉瘤類型好發(fā)于兒童和青少年，如尤文 氏肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤。相對于癌癥的發(fā)病率而言，肉瘤發(fā)病率低，僅 占成年人惡性腫瘤的1 ％，但其惡性程度高，發(fā)生血行轉(zhuǎn)移早，死亡率高，幾 乎平均每兩個(gè)肉瘤患者，就有一名發(fā)生死亡。疾病復(fù)雜性高，每一種肉瘤的生

3、 物學(xué)和分子亞型截然不同。目前臨床對肉瘤的初步診斷主要通過結(jié)合病人臨床 表現(xiàn)和x 線檢查、C T 掃描、核磁共振呈像( M R I ) 檢查、正電子發(fā)射斷層掃描 ( P E T ) 等影像學(xué)手段，當(dāng)懷疑為肉瘤時(shí)進(jìn)行穿刺和組織活檢以確診。肉瘤的 早期發(fā)現(xiàn)和診斷對肉瘤的預(yù)后起著決定性的作用，然而目前缺乏簡單易行的早 期診斷方法；活檢是肉瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但僅通過臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查判 斷，這不可避免地造成一部分非肉瘤患者接受活檢檢查；而且，因

4、為肉瘤的低 發(fā)病率和有眾多組織類型，即使對于經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家來說，肉瘤的確診仍碩士學(xué)位論文 ( M F H ) 、脂肪肉瘤、骨肉瘤等肉瘤細(xì)胞上都能檢測到C D 2 4 8 的表達(dá)，且當(dāng) 肉瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)上清中也可以檢測到C D 2 4 8 分子。C D 2 4 8 分子 在慢性腎臟性疾病患者體內(nèi)發(fā)生過量表達(dá)，參與腎臟纖維化過程，與腎臟纖維化程 度相關(guān)。除此之外，C D 2 4 8 也在多種癌癥、關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)發(fā)生過量表達(dá)。

5、綜上所述，我們擬在本研究中制備抗C D 2 4 8 多克隆抗體，并建立C D 2 4 8 分子的雙抗體夾心E L I S A 檢測方法，為后續(xù)臨床肉瘤、各種癌癥、慢性腎臟 病、關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病患者血清中C D 2 4 8 分子的檢測奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【目的】 1 ．采用原核表達(dá)的方式獲得C D 2 4 8 蛋白； 2 ．獲得C D 2 4 8 兔源性、鼠源性多克隆抗體； 3 ．建立E n d o s i a l i n ／T E M l

6、( C D 2 4 8 ) 的雙抗體夾心E L I S A 檢測方法。 4 ．對建立的E n d o s i a l i n ／T E M l ( C D 2 4 8 ) 的雙抗體夾心E L I S A 檢測方法進(jìn)行 初步評價(jià)。 【方法】 1 ．構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)純化獲得目的C D 2 4 8 蛋白 依照趙愛志博士贈送的p G E X 一2 T K ／C D 2 4 8 載體中人C D 2 4 8 基因序列及表 達(dá)載體p M

7、 A L - 5 x 多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，P C R 擴(kuò)增C D 2 4 8 片段。經(jīng) T 載體連接后，雙酶切構(gòu)建到p M A L 一5 x 原核表達(dá)載體。將測序驗(yàn)證的p M A L 一 5 x ．C D 2 4 8 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌B L 2 1 ，I P T G 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，S D S ． P A G E 電泳確定目的蛋白條帶位置是否符合預(yù)期。鑒定目的蛋白表達(dá)形式。對 以包涵體表達(dá)為主的p M A L - 5