EMT機制在膽道閉鎖患兒膽管纖維化改變中作用的探討.pdf

1、目的：
　　 膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰兒期引起膽汁淤積性黃疸的一種常見疾病，嚴重危及嬰幼兒生命。其發(fā)病率為1/14000～1/10000。臨床上常與新生兒特發(fā)性肝炎難鑒別。盡管隨著Kasai手術(shù)的廣泛開展，使膽道閉鎖患兒獲得更多的生存機會，但在術(shù)后十年的生存率僅為10～20％，而且有70％～80％的患兒有進行性的膽管破壞和肝纖維化，最終需要肝移植。BA病因至今尚不清楚，越來越多的人認為圍生期病毒感染在

2、BA的發(fā)生中起重要作用，而病毒感染通過哪些途徑導致膽管進行性炎癥、退化及肝纖維化目前尚不清楚。
　　 目前研究認為在組織器官慢性纖維化中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelium-mesenchymal transition，EMT）機制發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，EMT是指分化成熟的極化上皮細胞喪失上皮/內(nèi)皮細胞特征，向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，使其具有更大的活性和遷移性，這一過程在胚胎發(fā)育、組織再生、組織器官纖維化、癌細胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

3、生理狀態(tài)下，EMT是組織器官重要的創(chuàng)傷修復機制，組織器官損傷后通過EMT機制形成纖維瘢痕達到創(chuàng)傷修復，但這一過程持續(xù)存在則為病理狀態(tài)，可造成組織器官纖維化、硬化，這種轉(zhuǎn)化機制在毛細支氣管、腎小管等管狀組織纖維化中的研究較早、報道較多，而且最近EMT已經(jīng)成為終止、逆轉(zhuǎn)腎臟損傷后腎小管進行性纖維化的重要治療靶點。最近有研究認為EMT可能是參與BA中硬化性膽管炎的重要病理機制，在此過程中膽管上皮細胞逐漸喪失上皮細胞特性，并逐漸表現(xiàn)出間充質(zhì)細胞

4、特性，一系列重要的細胞因子CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1等也參與了這一重要的病理過程。CK-19為膽管細胞特異性細胞因子，可直接反應膽管上皮細胞形態(tài)及數(shù)量的變化；研究表明，F(xiàn)ibronectin為間充質(zhì)細胞特異性細胞因子，能直接影響細胞骨架成分的形成與組裝[7]，增強細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)間的粘附能力，在正常肝臟組織上皮類細胞中不表達，若在BA患兒肝臟上皮類細胞中表達，則可作為EMT機制激活的早

5、期信號；轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1是體內(nèi)作用最強和最廣泛的影響纖維產(chǎn)生的細胞因子[8]，通過TGF-β、smad信號通路使纖維化過程持續(xù)并進一步惡化[9～10]；Hes-1為胚胎發(fā)育過程中Notch信號通路的重要下游信號，與先天性發(fā)育異常有密切關(guān)系，Hes-1的表達受Notch信號的調(diào)節(jié)[11]。但上述指標在膽道閉鎖患兒肝臟組織膽管纖維化過程中是否起作用，又發(fā)揮著怎樣的作用等問題目前仍不清楚。因此本文從膽管上皮細胞是否發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、是否

6、伴有纖維化等炎癥因子的參與、是否伴有胚胎發(fā)育信號的激活三方面綜合分析，對BA患兒膽管病理改變規(guī)律進行深入研究，為進一步探索新的治療方法奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究以經(jīng)手術(shù)證實為BA患兒的肝臟病理標本和無肝膽系統(tǒng)畸形的同年齡段尸檢患兒肝臟標本為研究對象，采用免疫組織化學染色方法觀察CK-19、Fibronectin、TGF-β1、Smad3和Hes-1在肝臟組織中表達和分布情況，探討EMT機制在BA中發(fā)揮的作用，了解BA早期患兒肝臟組

7、織膽管的病理變化規(guī)律，為深入了解BA患兒肝臟組織的病理演變規(guī)律提供重要實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、標本制備及分組
　　 經(jīng)術(shù)前超聲、MRCP、術(shù)中所見、術(shù)中膽道造影證實為BA患者25例為病例組，術(shù)中無菌取活檢肝組織約0.5cmx0.5cmx0.5cm大小病理標本，用4％多聚甲醛固定；對照組為無肝膽系統(tǒng)畸形的同年齡段尸檢患兒5例，取肝組織，并用4％多聚甲醛固定。
　　 二、免疫組織化學技術(shù)
　

8、　 應用免疫組織化學方法分別檢測CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1在對照組和病例組肝臟組織標本中的分布和表達情況。
　　 三、數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以（）±s表示，數(shù)值比較采用t檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、膽管上皮細胞特異性細胞因子CK-19在BA組肝臟組織免疫組化染色中表達顯著，大量毛細

9、膽管增生，膽管失去正常管腔結(jié)構(gòu)，無固定形態(tài)，部分膽管上皮細胞表型喪失，形態(tài)不一，分布紊亂，且有膽汁淤積的膽管管腔結(jié)構(gòu)變化明顯，膽管上皮細胞形態(tài)變化嚴重。CK-19在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽性細胞數(shù)（96.33±3.28個/HP），多于對照組（20.58±1.15個/HP），平均光密度為0.413±0.058，高于對照組0.264±0.02l，與對照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2、纖維化

10、早期指標Fibronectin在BA組肝臟組織免疫組化染色中，肝細胞間、匯管區(qū)纖維組織及膽管上皮細胞均有表達，但在膽管上皮細胞表達顯著。Fibronectin在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽性細胞數(shù)為57.24±2.08個/HP，多于對照組的0個/HP，P<0.001，病例組平均光密度為0.305±0.078高于對照組，對照組為0.093±0.001，P<0.001，其差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3、轉(zhuǎn)化生長因子TG

11、F-β1在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中染色部位廣泛分布于肝細胞、膽管上皮細胞、門管區(qū)部分纖維結(jié)構(gòu)及周邊其它細胞內(nèi)，且肝細胞與周圍組織結(jié)構(gòu)染色更加明顯，較膽管上皮細胞表達強烈。TGF-β1在病例組肝臟組織染色中，平均膽管上皮陽性細胞數(shù)（85.16±2.65個/HP），多于對照組（20.25±1.78個/HP），平均光密度為0.396±0.030，高于對照組0.241±0.021，與對照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計學意義。

12、　　 4、Smad3在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中，肝細胞及膽管上皮細胞均存在，且膽管上皮細胞染色明顯強于肝細胞，匯管區(qū)血管平滑肌細胞亦可呈輕度染色。Smad3在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽性細胞數(shù)（69.33±2.08個/HP），多于對照組（11.53±2.15個/HP），平均光密度為0.398±0.035，高于對照組0.254±0.028，與對照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計學意義。
　　 5、He

13、s-1在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中，膽管上皮細胞染色明顯強于對照組，染色主要位于細胞胞漿，較多上皮細胞表現(xiàn)為間充質(zhì)細胞表型，相鄰細胞之間相互融合，分布紊亂。Hes-1在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽性細胞數(shù)（81.58±2.38個/HP），多于對照組（12.97±2.73個/HP），平均光密度為0.408±0.063，高于對照組0.231±0.015，與對照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)