非洲防己堿降膽固醇活性評價(jià)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、高脂血癥是心腦血管類疾病的關(guān)鍵誘發(fā)因素之一，危害性大。高脂血癥是指血清中的總膽固醇（TC），甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-c）含量過高或者高密度脂蛋白（HDL-c）含量過低的一種全身性的代謝功能紊亂疾病。因而維持體內(nèi)膽固醇的代謝均衡是預(yù)防和醫(yī)治高脂血癥和心腦血管類疾病的主要途徑。黃連是我國的傳統(tǒng)中藥，民間的用藥歷史相當(dāng)悠久?，F(xiàn)在的臨床醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃連具備抗炎、抗菌、降血糖和降血脂等諸多效用。非洲防己堿具有異喹啉結(jié)構(gòu)，是黃連中

2、一個主要的活性成分。我們的研究主要采用金黃地鼠和HepG2細(xì)胞為模型，研究非洲防己堿的降膽固醇活性及其潛在的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　(1)首先探究了非洲防己堿的安全性。根據(jù)對昆明小鼠的急性毒性試驗(yàn)和 SD大鼠的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)表明非洲防己堿的 LD50值約為1524.6 mg/kg，在長達(dá)90天的實(shí)驗(yàn)周期中，與對照組比較，藥物組的動物在器官重量、血液學(xué)分析等各項(xiàng)臨床指標(biāo)的檢測中都沒有顯著的差別；對

3、處于對數(shù)期生長狀況良好的HepG2細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，檢測不同濃度的非洲防己堿對細(xì)胞毒性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)藥物濃度低于5μg/ml時，HepG2細(xì)胞成活率大于80％，沒有明顯毒性。所以，非洲防己堿是一種安全的化合物。
　　(2)初步探究了非洲防己堿的降膽固醇活性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，使用金黃地鼠作為模型探究非洲防己堿對其脂質(zhì)水平的影響。發(fā)現(xiàn)藥物可以顯著降低高脂高膽固醇誘導(dǎo)的金黃地鼠（HFHC）血清中TC，TG和 LDL-c的水平，同

4、時提高HDL-c的水平。此外，與高脂組相比，中劑量和高劑量的藥物組與可有效促進(jìn)糞便中總膽汁酸（TBA）的排泄分別達(dá)到21.8%和25.1%；在體外實(shí)驗(yàn)中，使用HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行油紅 O染色實(shí)驗(yàn)，探索非洲防己堿對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的影響，結(jié)果表明藥物可以有效的降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累水平。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，非洲防己堿具有良好的降膽固醇活性。
　　(3)探究非洲防己堿對金黃地鼠和HepG2細(xì)胞中膽固醇代謝關(guān)鍵基因的影

5、響。取金黃地鼠的肝臟組織勻漿和HepG2細(xì)胞的裂解液進(jìn)行qRT-PCR，western blot以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)，分別檢測控制膽固醇合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收和外排通路上的關(guān)鍵基因HMGCR、LDLR、ABST、APOA4、CYP8B1、CYP7A1和CYP27A1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非洲防己堿對這些基因有不同程度的調(diào)節(jié)作用，但值得注意的是，與高脂高膽固醇組相比，藥物組對基因 CYP7A1的調(diào)節(jié)作用最明顯，并且在動物和細(xì)胞中都能顯著提高CYP7A1

6、的表達(dá)。
　　(4)進(jìn)一步探究非洲防己堿對基因CYP7A1相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用。因?yàn)榛?CYP7A1的半衰期較短，CYP7A1的調(diào)控一般發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的過程中，所以我們使用qRT-PCR和western blot技術(shù)檢測了與調(diào)節(jié)CYP7A1相關(guān)的轉(zhuǎn)綠因子：HNF-4α、FTF、FXR、Prox1、SHP和 SREBP2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與高脂高膽固醇組比較，藥物組能夠顯著提高HNF-4α和FTF的表達(dá)，同時抑制SHP的表達(dá)。報(bào)告熒光素酶

7、轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非洲防己堿對這些啟動子活性區(qū)有不同程度的調(diào)節(jié)作用，尤其能夠顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子HNF-4α和FTF與CYP7A1上游啟動子的結(jié)合活性。分子對接的分析結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，再次證明了非洲防己堿通過促進(jìn)HNF-4α和FTF表達(dá)以及與CYP7A1的結(jié)合活性，提高CYP7A1的表達(dá)量。
　　總之，非洲防己堿具有較高的降膽固醇活性，主要是通過促進(jìn)HNF-4α和FTF表達(dá)以及與CYP7A1的結(jié)合活性，提高CYP7A1的表