精細(xì)免疫分型方法的建立及在Wiskott-Aldrich綜合征患兒中的應(yīng)用.pdf

1、目的：建立用雙平臺(tái)法（流式細(xì)胞儀和血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞亞類絕對(duì)數(shù)及相對(duì)數(shù)的流式方法，分析更精細(xì)的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量，并將此方法應(yīng)用于 Wiskott-Aldrich綜合征患兒，全面評(píng)估患兒免疫功能。
　　方法：取人EDTA抗凝外周血500μl，200μl用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)得淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)；300μl用于流式細(xì)胞分析，通過特異性單克隆抗體與細(xì)胞表面抗原作用，測(cè)得所需淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)數(shù)。各淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)數(shù)（百分率）×淋巴

2、細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，即得到各淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)。采用此方法檢測(cè)2014年6月至2015年3月于我院就醫(yī)的20例男性WAS患兒，年齡4月到4歲不等，這些WAS患兒均經(jīng)基因檢測(cè)及 WASp蛋白檢測(cè)確診。利用精細(xì)免疫分型方法，從傳統(tǒng)淋巴細(xì)胞分類、B細(xì)胞精細(xì)免疫分型和T細(xì)胞精細(xì)免疫分型分析WAS患兒淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化。
　　結(jié)果：成功建立精細(xì)免疫分型流式檢測(cè)方法，并通過全血標(biāo)本與PBMC標(biāo)本對(duì)比證實(shí)全血標(biāo)本檢測(cè)是可靠的。檢測(cè)WAS患兒所有細(xì)胞亞

3、群均經(jīng)過正態(tài)檢驗(yàn)，正態(tài)分布的指標(biāo)采取配對(duì) T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；非正態(tài)分布的指標(biāo)采取Wilcoxon配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。WAS患兒Th細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)數(shù)均低于正常同齡對(duì)照；NK細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和相對(duì)數(shù)明顯高于正常對(duì)照；而 B細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)數(shù)明顯低于正常兒童；WAS患兒CD8 na?ve亞群百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)數(shù)均明顯少于正常對(duì)照；CD8 EM亞群百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)數(shù)大于正常對(duì)照；WAS患兒CD8 TEMRA和CD8 CM亞群比例增高，與正

4、常對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WAS患兒B細(xì)胞4個(gè)亞群（記憶、初始、過渡B細(xì)胞和漿母細(xì)胞）明顯低于正常對(duì)照，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：（1）成功建立了使用微量抗凝外周血檢測(cè)精細(xì)淋巴細(xì)胞亞群的多色流式分析方法，利用本方法進(jìn)行的正常兒童免疫細(xì)胞精細(xì)分型參考范圍正在制定中。（2）本研究檢測(cè)了WAS患兒中20群淋巴細(xì)胞精細(xì)亞群的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)WASp缺陷導(dǎo)致外周血B細(xì)胞及亞群數(shù)量明顯下降，外周血中 B細(xì)胞分布異常，免疫穩(wěn)態(tài)紊亂；在非感染狀態(tài)下