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1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞分化及神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響姓名:秦潔申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師:許予明閆福嶺20040520鄭州大學(xué)201)4屆碩士研究生學(xué)位論文大鼠骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞分化及神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)神經(jīng)元樣塋I|I胞的影響的神經(jīng)元樣細(xì)胞的保護(hù)作用。為MSCs在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法:取成年健康SD大鼠股骨和脛骨骨髓,密度梯度離心法分離獲取骨髓
2、單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearcells,MNCs)。多次洗滌后,將細(xì)胞沉淀接種于含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM(LDMEM)培養(yǎng)液中,置于37。C、5%C02、飽和濕度的C02孵箱中培養(yǎng),細(xì)胞融合后用O25%胰酶消化傳代。培養(yǎng)36代的細(xì)胞接種于塑料培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)皿時(shí),采用堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactorbFGF)培養(yǎng)24h,以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。然后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞應(yīng)用二甲
3、亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和丁羥茴醚(butylatedhydroxyanisole,BHA)對(duì)大鼠MSCs(rMSCs)進(jìn)行體外定向誘導(dǎo)分化;對(duì)照組細(xì)胞(未誘導(dǎo)細(xì)胞)不加任何誘導(dǎo)劑。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)誘導(dǎo)1h、3h后神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物一巢蛋白(nestin)的表達(dá),以及誘導(dǎo)5h后神經(jīng)元標(biāo)記物一神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物一膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋
4、白(glailfibfillaryacidicprotein,GFAP)的表達(dá),分別計(jì)數(shù)各種分化細(xì)胞的陽性率。誘導(dǎo)5h后,分別用含三種不同濃度GMl的DMEM培養(yǎng)液對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng),另設(shè)DMEM組、血清組和誘導(dǎo)液組,分別用不含血清的DMEM培養(yǎng)基、含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液和含抗氧化劑的誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng),24h、48h后分別用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行NSE鑒定。結(jié)果:1分離后的大鼠骨髓MSCs(rMSCs)在體外培養(yǎng)條件下
5、,呈增殖性生長(zhǎng)。傳代后的rMSCs約7d左右可擴(kuò)增一倍。2rMSCs經(jīng)誘導(dǎo)1h后,即有部分細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài),誘導(dǎo)5h結(jié)束時(shí),大部分細(xì)胞具有典型神經(jīng)元樣形態(tài):較多的神經(jīng)元樣細(xì)胞聚集在一起,相鄰細(xì)胞間的軸突聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀。3對(duì)照組rMSCs(未誘導(dǎo)rMSCs)僅表達(dá)少量nestin和NSE,陽性率分別為18%O8%和56%29%。實(shí)驗(yàn)組rMSCs誘導(dǎo)1h、3h后nestin陽性率分別為4020/033%和27O%29%,nestin的表達(dá)呈
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