REG3A促進AD-HIES支氣管上皮細胞增殖修復的作用機制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：AD-HIES患兒肺部金葡菌感染后炎癥反應、肺組織破壞程度和REG3A的表達
　　目的:闡明常染色體顯性遺傳高IgE綜合征（AD-HIES）患兒肺部金葡菌感染后炎癥反應和肺組織破壞性損傷程度；探索AD-HIES患兒肺部反復金葡菌感染致肺組織破壞損傷的分子機理；明確AD-HIES患兒STAT3基因突變對肺組織局部IL-17、IL-22和REG3A表達水平的影響。
　　方法:對10例AD-

2、HIES患兒肺炎情況、肺部感染的病原菌和肺部合并癥相關臨床資料進行統(tǒng)計分析。肺組織病理切片進行HE染色觀察肺組織結(jié)構(gòu)改變。Bio-plex懸液芯片系統(tǒng)檢測AD-HIES患兒血漿Th17相關的細胞因子的表達水平。采用流式細胞術檢測AD-HIES患兒外周血Th17細胞和IL-17+γδT細胞數(shù)量。免疫組化檢測肺組織p-STAT3、IL-17、IL-22和REG3A表達水平。
　　結(jié)果:10例AD-HIES患兒均有反復肺炎，7例有典型的

3、金黃色葡萄球菌肺炎，其中5例伴有“肺大泡”，2例接受肺葉切除手術。肺組織HE染色結(jié)果顯示AD-HIES患兒肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，感染灶內(nèi)中性粒細胞較少，嗜酸性粒細胞大量聚集。Bio-plex懸液芯片系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)AD-HIES患兒與健康對照兒童比較，血漿IL-17濃度降低（P＜0.05），IL-6濃度升高（P＜0.001），IL-22濃度無明顯差異。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)AD-HIES患兒與健康對照兒童比較，外周血Th17（P＜0.001）和I

4、L-17+γδT細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。肺組織免疫組化檢測結(jié)果顯示AD-HIES患兒肺組織p-STAT3、IL-17、IL-22和REG3A表達水平明顯降低。
　　結(jié)論: AD-HIES患兒自幼易患肺炎，以金葡菌肺炎為主。金葡菌肺部感染致肺組織破壞損傷嚴重，提示AD-HIES患兒肺組織修復功能可能存在缺陷。STAT3基因突變導致Th17和IL-17+γδT細胞數(shù)量減少，IL-17表達水平下降，以及肺組織IL-22、p-S

5、TAT3和REG3A表達降低可能是AD-HIES患兒反復肺部金葡菌感染和肺組織修復功能缺陷的主要原因。
　　第二部分：AD-HIES相關STAT3基因突變抑制支氣管上皮16HBE細胞REG3A表達
　　目的:闡明AD-HIES相關STAT3基因三種突變R382W、V637M和T620S對支氣管上皮16HBE細胞REG3A表達的影響。探索促進REG3A表達的調(diào)節(jié)因素及其機制。
　　方法:STAT3野生型質(zhì)粒（STAT3-

6、Wt）和三種STAT3突變質(zhì)粒（STAT3-R382W、STAT3-V637M和STAT3-T620S）分別轉(zhuǎn)染16HBE細胞后，Western blot驗證STAT3質(zhì)粒在16HBE細胞中的表達。金葡菌感染16HBE細胞后，Real-time PCR檢測REG3A、IL-6、IL-17和IL-22的差異表達。利用不同濃度的IL-6、IL-17或IL-22處理16HBE細胞，Real-time PCR和Western blot檢測分析1

7、6HBE細胞中REG3A表達水平的變化。最后，給予金葡菌感染或最佳作用濃度的IL-17和L-22處理轉(zhuǎn)染STAT3突變質(zhì)粒的16HBE細胞，Western blot檢測REG3A和p-STAT3表達水平，比較STAT3基因不同位點的突變對REG3A表達的影響。
　　結(jié)果:金葡菌感染16HBE細胞后，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示REG3A和IL-6 mRNA表達水平明顯升高，而IL-17和IL-22無表達；Western

8、blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)金葡菌明顯上調(diào)16HBE細胞 REG3A、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平。金葡菌感染STAT3基因突變的16HBE細胞，Western blot檢測結(jié)果顯示，R382W、V637M和T620S均明顯抑制REG3A表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)STAT3基因突變影響STAT3磷酸化，從而顯性負性調(diào)控REG3A表達。利用不同濃度的IL-6、IL-17或 IL-22處理16HBE細胞，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示2

9、50ng/ml IL-6、50ng/ml IL-17或400ng/ml IL-22可顯著上調(diào)REG3A表達水平。給予最佳作用濃度的IL-17和L-22處理轉(zhuǎn)染STAT3突變質(zhì)粒的16HBE細胞，Western blot檢測結(jié)果顯示，R382W、V637M和T620S均明顯抑制STAT3磷酸化。
　　結(jié)論:金葡菌和一定濃度的IL-6、IL-17和IL-22細胞因子通過誘導16HBE細胞STAT3磷酸化，上調(diào)REG3A的表達水平。AD

10、-HIES相關STAT3基因突變（R382W、V637M和T620S）顯性負性調(diào)控16HBE細胞內(nèi)源性STAT3磷酸化，從而抑制REG3A表達。
　　第三部分：REG3A通過PI3K/AKT信號通路促進AD-HIES STAT3基因突變的16HBE細胞增殖
　　目的:闡明REG3A對STAT3基因突變的16HBE細胞增殖的促進作用。探索PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白表達水平在REG3A促進16HBE細胞增殖中的變化。明確R

11、EG3A促進STAT3基因突變的16HBE細胞增殖的信號通路。
　　方法:重組REG3A、IL-17和IL-22分別處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細胞，Cell Counting Kit-8實驗方法檢測不同STAT3基因突變類型的16HBE細胞增殖情況。利用PI3K抑制劑（Wortmannin）和重組REG3A聯(lián)合或分別處理16HBE細胞，Cell Counting Kit-8實驗方法檢測16HBE細胞增殖情況。Weste

12、rn blot檢測重組REG3A處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細胞后，REG3A受體EXTL3和PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白表達水平的變化。
　　結(jié)果:重組REG3A、IL-17和IL-22分別處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細胞，Cell Counting Kit-8檢測結(jié)果顯示重組REG3A能夠促進STAT3基因突變的16HBE細胞增殖，表明REG3A促進16HBE細胞增殖并不依賴STAT3信號通路；而IL-

13、17和IL-22對STAT3基因突變的16HBE細胞增殖無影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與重組REG3A單獨處理組比較，重組REG3A和PI3K抑制劑聯(lián)合處理16HBE細胞后，細胞增殖能力降低，說明REG3A通過PI3K信號通路促進16HBE細胞增殖。Western blot檢測結(jié)果顯示，重組REG3A上調(diào)其受體EXTL3的表達；重組REG3A處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細胞后，p-AKT蛋白表達水平升高；而IL-17和IL-22對S