5-FU富集支氣管上皮細(xì)胞株干細(xì)胞群體的分子機(jī)制研究.pdf

1、先天性氣管狹窄或閉鎖、肺部惡性腫瘤使氣管的結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重?fù)p傷，需外科重建。但異種移植無(wú)法避免排斥反應(yīng)，需終生應(yīng)用免疫抑制劑，增加了感染及患腫瘤的危險(xiǎn)性。如能使用氣管干細(xì)胞移植，重建完整的氣管上皮，則給上述患者的治療帶來(lái)希望。
　　 我們的研究組利用5-FU制作了氣管的損傷、修復(fù)模型。Oct3/4、Nanog和Sox2在正常的支氣管上皮為陰性表達(dá)。在5-FU處理之后，正常的增殖期氣管上皮脫落，僅有少量GO期細(xì)胞保留在基底膜上，

2、此時(shí)出現(xiàn)Oct3/4、Nanog和Sox2的陽(yáng)性表達(dá)。隨后，Oct3/4、Nanog和Sox2陽(yáng)性的細(xì)胞逐漸增多。當(dāng)細(xì)胞分化為纖毛細(xì)胞、粘液細(xì)胞或基底細(xì)胞時(shí)，重建了假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，而Oct3/4、Nanog和Sox2陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，最終消失。我們認(rèn)為體細(xì)胞Oct3/4、Nanog和Sox2由陰變陽(yáng)，可能發(fā)生了再編程，而后干細(xì)胞分化為纖毛細(xì)胞、粘液細(xì)胞或基底細(xì)胞，此時(shí)Oct3/4、Nanog和Sox2由陽(yáng)變陰，再現(xiàn)了干細(xì)胞分化過(guò)程。

3、并提出Oct3/4、Nanog和Sox2為氣管干細(xì)胞的標(biāo)志物，那么為什么在損傷修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)有規(guī)律的變化呢？進(jìn)一步的研究證明，在5-FU處理后，體細(xì)胞Oct3/4、Nanog和Sox2的DNA啟動(dòng)子發(fā)生去甲基化，組蛋白乙?；旧|(zhì)重塑，這些已在大鼠及人支氣管器官實(shí)驗(yàn)中得到證明。本研究觀察經(jīng)5-FU處理后，富集分離人支氣管上皮細(xì)胞株中的干細(xì)胞，并解析干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)。
　　 材料和方法：
　　 一、材料與試劑
　

4、　 人支氣管上皮細(xì)胞株HBE由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代，實(shí)驗(yàn)中所用為生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。BALB/c Nu裸鼠，雄性5～6周，16～18克，購(gòu)自上海茂生生物科技發(fā)展有限公司。無(wú)支原體胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、MTT、5-FU、Hoechst33342、Verapamil、PI、Giemsa染色液、Oct3/4單克

5、隆抗體、Sox2單克隆抗體、P63單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體、Alpha fetoprotein單克隆抗體、人肌動(dòng)蛋白actin(SM)單克隆抗體、人微管蛋白Ⅲ單克隆抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒、4，6-diamidino-2-phenylindole、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG、TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、EGF、bFGF、胰島素、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Western細(xì)胞裂解液、

6、考馬斯亮藍(lán)。
　　 二、方法
　　 1、MTT實(shí)驗(yàn)
　　 將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔含103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，空白孔和對(duì)照孔分別加入200ul培養(yǎng)基，干預(yù)孔加入化療藥物和培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至干預(yù)后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行OD值的測(cè)定。每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO，490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的空白孔做對(duì)照。計(jì)算抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 2、流式細(xì)胞儀分選SP細(xì)胞<

7、br>　　 消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，待分選細(xì)胞分兩組處理：一組避光加入終濃度為5μg/ml Hoechst33342，另一組在避光加入終濃度為5μg/mlHoechst33342的同時(shí)，加入50μmol/L的維拉帕米(verapamil)作為對(duì)照。避光37℃孵育90min。孵育過(guò)程中每15min要充分混勻細(xì)胞。90min后，細(xì)胞4℃離心，1000rpm離心10min，重懸于含2% FBS的冰PBS中，加入

8、終濃度為2μg/ml的PI，標(biāo)記死細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分選SP細(xì)胞：Hoechst33342染料在350 nm處被激發(fā)，發(fā)射光藍(lán)光424nm/BP44，紅光660nm/BP20。
　　 3、細(xì)胞免疫熒光
　　 將細(xì)胞接種于24孔板中培養(yǎng)生長(zhǎng)。貼壁后按40μg/ml的濃度加入5-FU，24 h后測(cè)免疫熒光。4%多聚甲醛室溫固定15min。Triton X-100處理，血清封閉后分別滴加Oct3/4，Sox2，P63，β-cat

9、enin-抗，4℃孵育過(guò)夜。避光加入TRITC標(biāo)記的熒光二抗，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后，倒置熒光顯微鏡BX51(Olympus，Tokyo，Japan)觀察結(jié)果。
　　 4、Western印跡實(shí)驗(yàn)
　　 收集5-FU作用前后的HBE細(xì)胞，按蛋白抽提試劑盒說(shuō)明抽提細(xì)胞總蛋白，加入1×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5min，離心后上樣。12%SDS-PAGE電泳分離，恒壓濕轉(zhuǎn)膜120mins，含5%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉2h

10、rs，一抗分別用Oct3/4、Sox2、P63、β-catenin和β-actin，4℃孵育過(guò)夜。HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或兔抗山羊IgG或山羊抗小鼠IgG作為二抗，室溫孵育2hrs，洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像。相同條件下用β-actin作為內(nèi)對(duì)照。
　　 5、集落形成實(shí)驗(yàn)
　　 消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞做梯度倍數(shù)稀釋?zhuān)疵棵?0、100、200個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于含10 ml37℃預(yù)溫的培養(yǎng)液中。在37℃

11、、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。14天后，終止培養(yǎng)，加入純甲醇5 ml，固定15 min。去固定液，加Giemsa應(yīng)用染色液染30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。計(jì)算克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%
　　 6、無(wú)血清+生長(zhǎng)因子懸浮培養(yǎng)富集干細(xì)胞
　　 HBE細(xì)胞用5-FU(40μg/ml)處理48h后，棄去加藥培養(yǎng)液，消化成單細(xì)胞懸液。按1×104個(gè)/ml接種于含EGF20ng/ml、bFG

12、F20ng/ml和胰島素4μg/ml的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。每2天加1次生長(zhǎng)因子，1周換液2次，培養(yǎng)2周。每天觀察經(jīng)5-FU處理前后的HBE細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中形成干細(xì)胞球的過(guò)程。
　　 7、裸鼠移植實(shí)驗(yàn)
　　 選擇5周齡的雄性裸鼠，5-FU處理前后細(xì)胞按5×105個(gè)/200μl PBS，進(jìn)行接種。每周觀察2次，移植4周后給裸鼠施行安樂(lè)死。稱(chēng)量腫瘤大小，重量，拍照。腫瘤切取后常規(guī)4%多聚甲醛固定，石蠟包

13、埋，制作病理切片，HE染色，免疫組織化學(xué)染色。
　　 8、HE染色
　　 標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片。二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，蘇木素染核，鹽酸酒精分化。自來(lái)水沖洗返藍(lán)20min，伊紅染色。梯度酒精脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。
　　 9、組織切片免疫組化
　　 標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片。經(jīng)脫蠟，脫苯，水化后，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法(

14、S-P法)檢測(cè)組織中Oct3/4、P63、Alpha fetoprotein、classⅢβtubulin、肌動(dòng)蛋白actin的蛋白表達(dá)情況。
　　 10、免疫熒光雙染
　　 將細(xì)胞接種于24孔板中培養(yǎng)生長(zhǎng)。貼壁后按40μg/ml的濃度加入5-FU，24 h后測(cè)免疫熒光。4%多聚甲醛室溫固定15min。Triton X-100處理，小牛血清封閉后分別滴加Oct3/4-抗工作液，4℃孵育過(guò)夜。避光加入TRITC標(biāo)記的熒光二

15、抗，馬血清封閉后分別滴加二標(biāo)一抗(H3K4Me2，H3K9Ace，H3K9Me3，H3K27Me3，HP1-α，PML)，37℃孵育2.5h。避光加入FITC標(biāo)記的二標(biāo)熒光二抗，37℃孵育1h。DAPI復(fù)染細(xì)胞核后，倒置熒光顯微鏡BX51(Olympus，Tokyo，Japan)觀察結(jié)果。
　　 11、透射電鏡觀察
　　 取1mm×1mm×1mm大小組織，2.5%戊二醛固定24h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切

16、厚度為50～70nm的切片，甲苯胺藍(lán)染色，電鏡觀察、拍片、記錄。
　　 12、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)至少經(jīng)過(guò)3次實(shí)驗(yàn)獲得，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、5-FU對(duì)HBE細(xì)胞增殖的影響
　　 利用MTT的方法來(lái)分析5-FU對(duì)HBE細(xì)胞增殖的影響。不同濃度的5-FU作用于HBE細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)有不同程度的抑制，這種抑制呈時(shí)間劑量依賴(lài)

17、性。我們選用5-FU40μg/ml作用24h來(lái)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　 二、5-FU作用后流式細(xì)胞儀分析SP細(xì)胞比例增多
　　 加入PI染料排出死細(xì)胞和細(xì)胞碎片后，對(duì)5-FU作用前后的HBE細(xì)胞進(jìn)行了SP細(xì)胞分選。P3門(mén)顯示的SP細(xì)胞，能排出Hoechst33342染料。在正常的HBE細(xì)胞中，SP細(xì)胞占0.5%；當(dāng)同時(shí)加入verapamil孵育30分鐘后，SP細(xì)胞的比例下降到0.2%。經(jīng)5-FU處理后，SP細(xì)胞增加為0.8

18、%，當(dāng)同時(shí)加入verapamil孵育30分鐘后，SP細(xì)胞的比例下降到0.2%。經(jīng)5-FU處理后，SP細(xì)胞的比例明顯增加。
　　 三、細(xì)胞免疫熒光
　　 1、5-FU作用后出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物陽(yáng)性表達(dá)
　　 為了檢測(cè)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物，對(duì)5-FU處理前后的細(xì)胞進(jìn)行了Oct3/4和Sox2的免疫熒光染色分析。Oct3/4和Sox2陽(yáng)性表達(dá)為核呈現(xiàn)明亮紅色染色。在正常的HBE細(xì)胞中，Oct3/4為幾乎為陰性表達(dá)；在5

19、-FU作用后，出現(xiàn)了Oct3/4的陽(yáng)性表達(dá)。Sox2的表達(dá)與Oct3/4是一致的。
　　 2、5-FU作用后出現(xiàn)分化的標(biāo)記物P63的低表達(dá)
　　 眾所周知，HBE細(xì)胞表達(dá)分化的標(biāo)記物P63。在正常的HBE細(xì)胞中，有P63的高陽(yáng)性表達(dá)；在5-FU作用后，P63的表達(dá)明顯降低，證實(shí)在5-FU作用后，出現(xiàn)了未分化的狀態(tài)。
　　 3、β-catenin的表達(dá)
　　 Wnt信號(hào)通路在控制干細(xì)胞的自我更新方面起著重要

20、作用，β-catenin是Wnt信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵因子。未經(jīng)5-FU作用的HBE細(xì)胞，β-catenin主要為胞膜和胞漿表達(dá)；在5-FU作用后，β-catenin出現(xiàn)表達(dá)增加并表現(xiàn)為核表達(dá)。
　　 四、Western blot分析
　　 在正常的HBE細(xì)胞中，Oct3/4，Sox2，β-catenin為低表達(dá)；而經(jīng)5-FU處理后，表達(dá)水平升高。P63在正常的HBE細(xì)胞中高表達(dá)，經(jīng)5-FU處理后表達(dá)水平下降。
　　

21、 五、5-FU作用后，克隆形成能力增強(qiáng)
　　 對(duì)5-FU作用前后的HBE細(xì)胞按材料和方法所述進(jìn)行了克隆形成能力的檢測(cè)。原始的HBE細(xì)胞的克隆形成率為7%。而經(jīng)5-FU處理后的細(xì)胞克隆形成率增加了2.5倍，達(dá)到了18%。并且形成的克隆體積更大，Giemsa染色更深。
　　 六、5-FU作用后，干細(xì)胞球形成能力增強(qiáng)
　　 HBE經(jīng)5-FU作用48h后，大部分細(xì)胞死亡，僅有一少部分細(xì)胞保存了下來(lái)。存活下來(lái)的細(xì)胞用胰酶消

22、化后加無(wú)血清培養(yǎng)液和生長(zhǎng)因子懸浮培養(yǎng)，觀察了干細(xì)胞球的形成能力。經(jīng)5-FU作用前后的HBE細(xì)胞按10000個(gè)/ml的密度接種。培養(yǎng)2周后從單細(xì)胞懸液形成的懸浮干細(xì)胞球可以看出未處理的分化的HBE細(xì)胞表現(xiàn)為低干細(xì)胞球形成能力，而5-FU作用后出現(xiàn)高的干細(xì)胞球形成能力，同時(shí)該細(xì)胞球與HBE細(xì)胞球相比，球體較大，折光性強(qiáng)，細(xì)胞間連接更緊密，難以區(qū)分細(xì)胞間界限。這些都說(shuō)明了存活下來(lái)的細(xì)胞有較高的自我更新能力。七、5-FU作用后，富集干細(xì)胞群體獲

23、得畸胎瘤形成能力
　　 為了比較5-FU作用前后HBE細(xì)胞是否有多分化能力，我們按5×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行裸鼠移植。在移植后4周，裸鼠被處死，對(duì)腫瘤進(jìn)行稱(chēng)重，拍照，HE染色。HBE細(xì)胞移植組沒(méi)有腫瘤形成，經(jīng)5-FU作用后的細(xì)胞移植組都觀察到腫瘤形成。經(jīng)HE染色及免疫組化染色證實(shí)該腫瘤為畸胎瘤。HE染色可見(jiàn)多層鱗片狀上皮細(xì)胞(外胚層)、平滑肌(中胚層)、腺上皮(內(nèi)胚層)組織。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見(jiàn)classⅢβtubulin陽(yáng)性表達(dá)

24、為神經(jīng)樣細(xì)胞，SM陽(yáng)性表達(dá)為平滑肌樣細(xì)胞。其中畸胎瘤有三個(gè)胚層分化?；チ龅男纬勺C實(shí)了其多能性。而干細(xì)胞巢呈現(xiàn)Oct3/4染色陽(yáng)性，說(shuō)明為富含干細(xì)胞的未分化組織。透射電鏡觀察該細(xì)胞核較大，核內(nèi)常染色質(zhì)多，均勻分布；異染色質(zhì)很少，未凝集成塊。細(xì)胞漿少，細(xì)胞間連接少見(jiàn)。提示該細(xì)胞為未分化的幼稚細(xì)胞。八、Oct3/4陽(yáng)性細(xì)胞與陰性細(xì)胞組蛋白修飾、染色質(zhì)狀態(tài)比較
　　 基因組的表達(dá)分析說(shuō)明了干細(xì)胞的分化很可能與異染色質(zhì)的增多有關(guān)。為了了

25、解在5-FU作用前后染色質(zhì)狀態(tài)的變化，我們先用Western blot的方法分析了特異性的組蛋白修飾的抗體。最近的研究說(shuō)明H3K4Me2和H3K9Ace是轉(zhuǎn)錄后活性的標(biāo)記物；而H3K9Me3和H3K27Me3是轉(zhuǎn)錄后抑制性標(biāo)記物。
　　 接下來(lái)，我們用相應(yīng)的特異性抗體與Oct3/4做了免疫熒光雙染。在Oct3/4(+)的細(xì)胞中，H3K4Me2和H3K9Ace的表達(dá)也為陽(yáng)性。在Oct3/4(-)的細(xì)胞中，H3K4Me2和H3K9A

26、ce的表達(dá)也喪失。H3K9Me3和H3K27Me3是在Oct3/4(-)的細(xì)胞中出現(xiàn)，在Oct3/4(+)的細(xì)胞中喪失。在Oct3/4與組蛋白修飾之間的特異性聯(lián)系說(shuō)明組蛋白修飾與Oct3/4基因的染色質(zhì)形成有關(guān)。
　　 PML小體是參與核轉(zhuǎn)錄的因子，并與某些基因富集的常染色質(zhì)區(qū)域相聯(lián)系。為了檢測(cè)HP1-α與PML在這個(gè)過(guò)程中是如何表達(dá)的，做了Western blot和免疫熒光雙染分析。Western blot的結(jié)果顯示HP1-α

27、與PML蛋白在正常的HBE細(xì)胞中低表達(dá)，而在5-FU作用后的細(xì)胞中高表達(dá)。免疫熒光雙染顯示HP1-α在Oct3/4(+)的細(xì)胞中出現(xiàn)，而在Oct3/4(-)的細(xì)胞中消失。PML小體與組蛋白的乙?；D(zhuǎn)移酶相關(guān)，在5-FU作用后Oct3/4(+)細(xì)胞中數(shù)量較多，可達(dá)到15～20個(gè)；而在正常的Oct3/4(-)的細(xì)胞中，PML小體的數(shù)量較少，僅有3～5個(gè)。PML小體與Oct3/4細(xì)胞的特異性聯(lián)系說(shuō)明PML小體也與Oct3/4基因的染色質(zhì)形成有

28、關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、經(jīng)5-FU處理后，支氣管上皮細(xì)胞中SP細(xì)胞增加，出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)，克隆形成率提高，裸鼠移植后畸胎瘤形成率增高。本研究證明5-FU處理后能富集支氣管上皮細(xì)胞株中干細(xì)胞群體。
　　 2、表觀遺傳修飾支持Oct3/4可為氣管干細(xì)胞標(biāo)記物。
　　 3、5-FU作用支氣管上皮細(xì)胞后，組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑調(diào)控內(nèi)源性O(shè)ct3/4轉(zhuǎn)錄激活，從而富集氣管干細(xì)胞。
　　 4、經(jīng)