氯霉素全抗原合成的研究及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、氯霉素是第一個人工合成的廣譜抗生素，因其效高價廉，在我國畜牧業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，對畜禽疾病的控制和治療起到了重要的作用。隨著氯霉素的廣泛應(yīng)用及研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有許多毒、副作用，因此，必須控制氯霉素在動物性食品中的殘留，保障消費(fèi)者健康與安全。 本文分兩部分，第一部分將氯霉素(CAP，Chloramphenicol)與牛血清白蛋白((BSA)、卵清白蛋白(OVA)利用優(yōu)化的重氮化法、混合酸酐法、碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)及鑒定，分別作為免

2、疫抗原及包被抗原，免疫抗原注射免疫新西蘭大白兔獲得多抗血清。第二部分建立了快速檢測氯霉素的間接競爭ELISA方法，并通過實(shí)驗(yàn)，對檢測過程中的各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化。 分別應(yīng)用重氮化法、混合酸酐法、碳化二亞胺法將CAP與載體蛋白BSA偶聯(lián)制備人工合成抗原，以此作為免疫抗原，同法合成包被抗原。它們的紫外掃描光譜、SDS-PAGE電泳、動物免疫試驗(yàn)均表明偶聯(lián)成功。免疫2～3月齡新西蘭大白兔，獲得多抗CAP抗血清，用間接非競爭ELISA法測定

3、抗血清效價。數(shù)據(jù)顯示，混合酸酐法在合成氯霉素人工抗原方面較優(yōu)于其他兩種方法。本試驗(yàn)用過碘酸鈉改良法制備辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體，用辛酸—硫酸銨法、Sephadex-G-25、DEAE離子交換提純純化血清IgG，經(jīng)計算結(jié)合物中各項(xiàng)指標(biāo)，表明酶標(biāo)抗體標(biāo)記成功，并且通過SDS-PAGE電泳和直接ELISA測定也可得出酶標(biāo)抗體標(biāo)記成功。 采用混合酸酐法制得的免疫抗原免疫兔子得到的抗血清進(jìn)行間接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化EL

4、ISA工作條件，建立了間接競爭ELISA檢測CAP方法。方陣滴定法確定理想OVA-HS-HSA包被抗原的濃度為1.25μg/mL，酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-HRP)工作濃度為1：400以及多抗(SM2-PcAb)血清的工作濃度為1：12800。以上述實(shí)驗(yàn)條件為基礎(chǔ)，以系列稀釋的CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為檢測對象，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸直線方程為y=1.069-0.2633x，相關(guān)系數(shù)R2=0.9867，從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得知，此方法可測定的最適

5、范圍為10ng/mL～200ng/mL，最小檢測限約為0.001pg/mL。 本實(shí)驗(yàn)所建立的ELISA方法的精確度以批內(nèi)誤差(孔間差異)和批間誤差(板間差異)表示，結(jié)果表明孔間差異和板間平均差異分別為4.24﹪和9.20﹪，這表明方法精確度較好。添加回收率實(shí)驗(yàn)測得氯霉素對雞肉樣本在10～100ng/mL范圍內(nèi)的平均回收率為94.86﹪±9.55﹪。在可測定濃度范圍內(nèi)，氯霉素(CAP)抗血清與磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethaz