MicroRNA-17~92簇和MicroRNA-221在移植靜脈再狹窄中作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（Coronary artery bypass grafting，CABG）是缺血心肌血運(yùn)重建的重要手段，是目前治療冠心病的常用和有效方法。大隱靜脈是 CABG最常用的血管移植材料之一，其臨床使用率超過(guò)70%，然而長(zhǎng)期的隨訪結(jié)果顯示CABG術(shù)后1年近15%-25%的橋靜脈血管出現(xiàn)狹窄，術(shù)后10年再狹窄率超過(guò)50%。移植靜脈再狹窄是心血管外科領(lǐng)域尚未解決的重要臨床問(wèn)題，且目前尚無(wú)有效的防治措施，而基

2、因治療用于防治移植靜脈術(shù)后再狹窄具有很好的可行性和安全性，具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表型轉(zhuǎn)化、過(guò)度增殖、遷移到內(nèi)膜及產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)堆積是移植靜脈術(shù)后再狹窄發(fā)生的主要病理機(jī)制。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA參與了心血管病領(lǐng)域很多重要的生理和病理過(guò)程，也是調(diào)控 VSMC生物學(xué)功能的重要因子。miR-17~92簇是調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的重要 microR

3、NA之一，在多種腫瘤研究中，miR-17~92簇是腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的重要調(diào)控因子。此外，miR-221也是調(diào)控VSMC的促增殖、促遷移和抗凋亡的關(guān)鍵因子，通過(guò)調(diào)控靶基因p27(Kip1)和p57(Kip2)的下調(diào)從而促進(jìn)VSMC的增殖和表型轉(zhuǎn)換。
　　研究目的:
　　本課題擬通過(guò)構(gòu)建移植靜脈術(shù)后再狹窄動(dòng)物模型和VSMC增殖細(xì)胞模型明確miR-17~92簇是否參與VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖遷移的調(diào)控，及其在移植靜脈術(shù)后內(nèi)膜

4、增生形成中的作用機(jī)制。為了充分驗(yàn)證miRNA Sponge技術(shù)在移植靜脈再狹窄基因治療中的有效性和安全性，通過(guò)構(gòu)建 miR-221-Sponge進(jìn)一步明確是否可以有效抑制移植靜脈術(shù)后再狹窄的發(fā)生。
　　研究方法:
　　構(gòu)建大鼠移植靜脈再狹窄模型，應(yīng)用microRNA芯片篩選出與移植靜脈再狹窄發(fā)生密切相關(guān)的miRNAs，并通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證。構(gòu)建靜止型和去分化型VSMC模型，檢測(cè)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及miR-17~92前體表達(dá)情況

5、。構(gòu)建miRNA-17~92過(guò)表達(dá)和沉默腺病毒表達(dá)載體，應(yīng)用qRT-PCR、Western-blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)VSMC細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，細(xì)胞計(jì)數(shù)和Brdu法檢測(cè)細(xì)胞增殖，劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證miR-17~92簇調(diào)控的可能潛在靶基因。應(yīng)用miRNA Sponge技術(shù)敲除移植靜脈中miR-17~92和miR-221的表達(dá)，通過(guò)Poloxamer-407-胰蛋白酶混合凝膠經(jīng)血管外膜

6、途徑局部轉(zhuǎn)染移植靜脈，術(shù)后通過(guò)彩超評(píng)估移植靜脈吻合口血流動(dòng)力學(xué)情況，進(jìn)行HE染色測(cè)定移植靜脈內(nèi)膜增生情況，免疫組織化測(cè)定橋靜脈中VSMC增生情況，免疫熒光染色分析移植靜脈中VSMC表型轉(zhuǎn)化情況。
　　研究結(jié)果:
　　應(yīng)用microRNA芯片技術(shù)和 qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miRNA-17~92簇的6個(gè)成員（miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b，and miR-92a）在移植靜脈組織

7、中相對(duì)正常靜脈組織均表達(dá)上調(diào)。miR-17~92前體在VSMC增殖模型中表達(dá)水平增高，并對(duì)PDGF的刺激具有時(shí)間和濃度依賴性。通過(guò) miRNA Sponge抑制技術(shù)沉默miR-17~92的表達(dá)可顯著抑制 VSMC的增殖和遷移能力，同時(shí)增加VSMC收縮型特異性蛋白如SMA、Calponin和SM-MHC的表達(dá)。經(jīng)初步分析驗(yàn)證，PTEN可能是miR-17~92簇介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要潛在靶基因之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的miR-1

8、7~92簇Sponge和miR-221 Sponge局部基因治療，可有效抑制移植靜脈術(shù)后內(nèi)膜增生和 VSMC增殖和表型轉(zhuǎn)換，有效改善移植靜脈術(shù)后吻合口血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，且并未增加移植靜脈術(shù)后炎癥反應(yīng)的程度。
　　結(jié)論:
　　miR-17~92簇是參與VSMC增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換的重要的調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)調(diào)控靶基因PTEN促進(jìn)VSMC增殖和遷移。應(yīng)用miRNA Sponge技術(shù)靶向沉默miR-17~92簇和miR-221