MicroRNA-17-92促進胃癌干細(xì)胞自我更新及增殖的分子機制.pdf

1、目前研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤是由一小群具有自我更新能力和多向分化潛能的癌細(xì)胞引起和維持的。這一小群癌細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell)或腫瘤啟動細(xì)胞(Tumor initiating cell),它們與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、抵抗化療和放療殺傷密切相關(guān)。自我更新是腫瘤干細(xì)胞區(qū)別于普通癌細(xì)胞最重要的特征之一,也是腫瘤干細(xì)胞維持自身“干性”并最終引起腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根本原因。然而,腫瘤干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機制仍未完全闡明。<

2、br>　　miRNA是一類近年來新發(fā)現(xiàn)的長約19-22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因蛋白表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn),miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。成為一類新型的癌基因或抑癌基因。腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等多種生物學(xué)過程都與miRNA密不可分。雖然miRNA的序列很小,但是一個 miRNA可以調(diào)控多個基因,形成序列放大的基因調(diào)控通路;也可以受很多基因的調(diào)控,從而在生物體內(nèi)構(gòu)

3、成了一個龐大的復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。大量研究證明,miRNA也參與了干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞自我更新和多向分化潛能性的調(diào)節(jié)。例如 MiR-21、miR-134、miR-470通過靶向自我更新相關(guān)基因nanog、SOX2、OCT4調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的自我更新及分化。Let-7調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞的自我更新和增殖等。
　　胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,因此,我們的問題是:胃癌干細(xì)胞的自我更新是如何被調(diào)控的呢?它們是否與miRNA有關(guān)呢?如果是,又有

4、哪些miRNA調(diào)控了胃癌干細(xì)胞的自我更新和增殖呢?它們參與胃癌干細(xì)胞自我更新和增殖是通過怎樣的機制完成的?對指導(dǎo)臨床工作又有怎樣的意義?這些問題成為本課題研究的內(nèi)容。
　　【目的】
　　1、尋找與胃癌干細(xì)胞自我更新相關(guān)的miRNA;2、明確候選miRNA調(diào)控胃癌干細(xì)胞自我更新和增殖的作用;3、探討候選 miRNA在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。
　　【方法】
　　1、利用tumorsphere實驗和EpCAM+/

5、CD44+胃癌表面標(biāo)記物富集胃癌干細(xì)胞并進行驗證;2、利用細(xì)胞培養(yǎng)使胃癌干細(xì)胞貼壁分化,收集分化8小時、12小時、24小時和8天的細(xì)胞送miRNA芯片檢測,尋找表達(dá)逐漸缺失的miRNA分子,并利用Real-time PCR驗證芯片結(jié)果;3、構(gòu)建miRNA分子的慢病毒正義表達(dá)載體,分別感染胃癌細(xì)胞系并構(gòu)建篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞;4、利用tumorsphere實驗和NOD-SCID鼠成瘤實驗分別檢測miRNA對胃癌干細(xì)胞自我更新的影響;5、利用M

6、TT實驗、平板克隆形成試驗、裸鼠成瘤實驗等技術(shù)研究miRNA對胃癌細(xì)胞增殖的影響;6、利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫尋找miRNA促進胃癌細(xì)胞增殖和自我更新的靶基因,并通過報告基因?qū)嶒灪?Western Blot進行驗證;7、利用 real-time PCR檢測胃癌組織標(biāo)本內(nèi)miRNA的表達(dá)并分析其與臨床病理資料的關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1.EpCAM+/CD44+標(biāo)記物和tumorsphere腫瘤球形成實驗?zāi)軌蚋患赴└杉?xì)胞

7、>　　2011年,Han ME等人從胃癌臨床標(biāo)本內(nèi)鑒定出胃癌干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物是EpCAM+/CD44+。為了檢測在胃癌細(xì)胞系內(nèi)EpCAM+/CD44+的細(xì)胞是否也是胃癌干細(xì)胞,我們比較了兩個EpCAM+/CD44+含量完全相反的細(xì)胞系在無血清低粘附培養(yǎng)條件下的腫瘤球形成能力。在胃癌細(xì)胞系SGC7901中,80％的細(xì)胞表達(dá)EpCAM和CD44,并且大多數(shù)SGC7901細(xì)胞能夠在無血清低粘附的培養(yǎng)條件下形成腫瘤球,而0.2%表達(dá)EpC

8、AM+/CD44+標(biāo)記物的MKN28細(xì)胞無法在無血清低粘附的培養(yǎng)條件下生成腫瘤球。由于腫瘤球形成實驗是在體外檢測細(xì)胞自我更新能力的最佳實驗,我們利用流式細(xì)胞術(shù)從胃癌細(xì)胞系內(nèi)分選到了 EpCAM+/CD44+細(xì)胞和非EpCAM+/CD44+細(xì)胞,并利用腫瘤球形成實驗檢測他們的體外自我更新能力。15天后,85-95%的EpCAM+/CD44+細(xì)胞形成了腫瘤球,而只有15-20%的非EpCAM+/CD44+細(xì)胞形成了腫瘤球。并且,EpCAM+

9、/CD44+細(xì)胞形成的腫瘤球內(nèi)的腫瘤細(xì)胞明顯多于非 EpCAM+/CD44+細(xì)胞。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗顯示,104 EpCAM+/CD44+細(xì)胞形成的腫瘤熒光信號在第15、21和28天明顯強于105非EpCAM+/CD44+細(xì)胞。這些結(jié)果表明EpCAM+/CD44+也是體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系的干細(xì)胞標(biāo)記物并可以用于胃癌干細(xì)胞體外研究的模型。
　　腫瘤干細(xì)胞的一個重要的特征是多潛能性。因此我們利用上述發(fā)現(xiàn)檢測胃癌干細(xì)胞是否能夠在含有血清的普

10、通培養(yǎng)條件下分化。正如我們所料,通過利用 CFSE標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤球細(xì)胞在含有血清的培養(yǎng)條件下貼壁后增殖加快。利用real-time PCR檢測我們發(fā)現(xiàn)腫瘤球細(xì)胞較貼壁的細(xì)胞表達(dá)上皮標(biāo)記CK14和 CK18減少,但是,他們在含有血清的培養(yǎng)基內(nèi)貼壁分化后形態(tài)逐漸拉長,并表達(dá)較高的分化標(biāo)記CK14和CK18。EpCAM+/CD44+的腫瘤球細(xì)胞在含有血清的培養(yǎng)條件下的潛在分化能力表明胃癌干細(xì)胞具有多潛能性,并且一定有一個獨

11、特的機制能夠調(diào)節(jié)這一過程。
　　2.miR-19b/20a/92a在胃癌干細(xì)胞分化過程中表達(dá)減低
　　由于miRNA能夠調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化,我們培養(yǎng)了一大批富集了胃癌干細(xì)胞的腫瘤球細(xì)胞,并將這些細(xì)胞放入正常的含血清的培養(yǎng)基中使其貼壁分化,我們收集了分化8小時,12小時,1天和8天的細(xì)胞送miRNA芯片檢測。并尋找在此貼壁分化過程中表達(dá)逐漸缺失的miRNA分子。我們認(rèn)為在腫瘤干細(xì)胞貼壁分化過程中表達(dá)逐漸缺失的miRNA

12、分子可能維持了胃癌干細(xì)胞的自我更新,因此才能在貼壁分化過程中表達(dá)逐漸減低。利用 Anova分析,我們鑒定出了一些在胃癌干細(xì)胞貼壁分化過程中表達(dá)逐漸缺失的miRNA分子,其中,miR-19b/20a/92a的表達(dá)差別顯著,并引起我們注意。此外,miR-106a和miR-30d等分子也與miR-19b/20a/92a有著相似的表達(dá)形式。
　　為了驗證芯片結(jié)果,我們利用real-time PCR進一步檢測了miR-19b/20a/92a

13、在胃癌干細(xì)胞和貼壁分化細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)他們的確在貼壁8個小時后表達(dá)有所減低,貼壁1天后表達(dá)減低明顯,8天后進一步下降。我們用同樣的方法檢測了 miR-106a和miR-30d的表達(dá),發(fā)現(xiàn)他們?nèi)匀挥信cmiR-19b/20a/92a相似的表達(dá)形式。
　　由于 miR-19b、miR-20a和 miR-92a同屬于 miR-17-92基因簇,我們選擇了miR-19b/20a/92a進行了后續(xù)的深入研究。
　　3.過表達(dá)miR-1

14、9b/20a/92a能夠促進胃癌干細(xì)胞體外腫瘤球的形成
　　為了檢測是否miR-19b/20a/92a能夠維持胃癌干細(xì)胞的自我更新,我們將慢病毒攜帶的miR-19b/20a/92a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入從SGC7901細(xì)胞分選的EpCAM-/CD44-細(xì)胞,并利用real-time PCR驗證了轉(zhuǎn)染效率。過表達(dá)lenti-miR-19b/20a/92a較對照相比能夠顯著增加胃癌細(xì)胞的腫瘤球形成能力,表明胃癌細(xì)胞的自我更新能力得到顯著增高。此外

15、,lenti-miR-19b/20a/92a穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞形成的腫瘤球內(nèi)細(xì)胞數(shù)較對照組顯著增高。為了避免由于相關(guān)細(xì)胞變化導(dǎo)致的差異,我們又從 invitrogen公司購買了miR-19b/20a/92a的前體RNA和拮抗RNA,并分別瞬時轉(zhuǎn)染入EpCAM-/CD44-(或MKN28)細(xì)胞和EpCAM+/CD44+(從SGC7901細(xì)胞分離),real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率后仍然利用腫瘤球形成實驗檢測其對自我更新的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與

16、對照組相比,瞬時轉(zhuǎn)染miR-19b/20a/92a的前體RNA能夠顯著促進EpCAM-/CD44-和MKN28胃癌細(xì)胞的腫瘤球形成能力即自我更新能力。而瞬時轉(zhuǎn)染 miR-19b/20a/92a的拮抗RNA能夠顯著降低EpCAM+/CD44+細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的體外自我更新能力。我們的結(jié)果表明miR-17-92基因簇的miRNA分子通過增加胃癌細(xì)胞的腫瘤球形成數(shù)目和每個腫瘤球的細(xì)胞數(shù)來在無血清低粘附的培養(yǎng)條件下調(diào)節(jié)胃癌干細(xì)胞的自我更

17、新。
　　4.過表達(dá)miR-19b/20a/92a能夠促進腫瘤球細(xì)胞對胃癌化療藥物的耐受
　　有研究表明腫瘤干細(xì)胞能夠抵抗化療藥物的作用,從而導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生和繼發(fā)性腫瘤復(fù)發(fā)。我們利用MTT實驗檢測了腫瘤球細(xì)胞在胃癌化療藥物5-FU存在下的生長曲線:與對照組病毒相比,lenti-miR-19b/20a/92a感染的細(xì)胞形成的腫瘤球在化療藥物的存在下生存時間延長。這表明miR-19b/20a/92a不僅通過增加腫瘤球細(xì)胞的數(shù)

18、目,還通過誘導(dǎo)細(xì)胞對化療藥物的耐受來促進胃癌干細(xì)胞自我更新的維持。
　　5.過表達(dá)miR-19b/20a/92a能夠增加EpCAM+/CD44+細(xì)胞數(shù)
　　由于胃癌干細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物EpCAM+/CD44+,我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測是否pre-miR-19b/20a/92a轉(zhuǎn)染的細(xì)胞較對照組相比表達(dá)較多的EpCAM+/CD44+細(xì)胞表面標(biāo)記物。我們發(fā)現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染 pre-miR-19b/20a/92a能夠顯著增加EpCAM

19、+/CD44+細(xì)胞數(shù),而瞬時轉(zhuǎn)染 miR-19b/20a/92a的拮抗劑能夠顯著減低EpCAM+/CD44+細(xì)胞數(shù)。
　　6.過表達(dá)miR-19b/20a/92a能夠促進胃癌干細(xì)胞在NOD-SCID鼠中的自我更新
　　我們進一步檢測了過表達(dá)miR-19b/20a/92a對胃癌干細(xì)胞體內(nèi)自我更新的影響。為了更好的評估動物體內(nèi)的自我更新,我們利用本實驗室前期建立的熒光素酶標(biāo)記的SGC7901-Luc細(xì)胞系感染病毒并建立穩(wěn)定表達(dá)m

20、iR-19b/20a/92a的細(xì)胞系,并應(yīng)用real-time PCR驗證 miRNA表達(dá)水平。每只 NOD-SCID鼠背部注射2Χ103 lenti-miR-19b/20a/92a或者 lenti-NC形成的腫瘤球。28天后,所有注射lenti-miR-19b/20a/92a細(xì)胞的NOD-SCID鼠背部均形成了腫瘤,但是只有一只lenti-NC組的NOD-SCID鼠背部形成了腫瘤(P<0.001)。并且miR-19b/20a/92a感

21、染的細(xì)胞在注射第28天后形成的腫瘤塊已經(jīng)超過了3厘米,而NC組形成的腫瘤塊在第49天,即實驗的最終點才長到2厘米。HE染色結(jié)果表明,miR-19b/20a/92a感染的細(xì)胞在NOD-SCID鼠體內(nèi)產(chǎn)生了肝和肺轉(zhuǎn)移灶,而NC組沒有轉(zhuǎn)移。
　　7.miR-19b/20a/92a促進胃癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖
　　干細(xì)胞調(diào)節(jié)基因一般也與細(xì)胞的增殖相關(guān)。因此,我們繼而利用MTT實驗,平板克隆形成實驗和裸鼠成瘤實驗檢測了miR-19b/20

22、a/92a在胃癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖中的功能。體外增殖實驗顯示:miR-19b/20a/92a穩(wěn)定表達(dá)組較NC對照組促進了胃癌細(xì)胞的增殖,瞬時轉(zhuǎn)染 miR-19b/20a/92a的前體得到了相似的結(jié)果,而瞬時轉(zhuǎn)染miR-19b/20a/92a的拮抗物得到的結(jié)果相反。
　　為了驗證體外增殖實驗結(jié)果,我們利用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗進一步檢測miR-19b/20a/92a對胃癌細(xì)胞增殖的影響。我們利用實驗室前期建立的帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞系SGC790