骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膿毒癥小鼠血栓調(diào)節(jié)蛋白的影響研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察經(jīng)尾靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)后膿毒癥小鼠的生存情況。
　　2.觀察BMSCs移植后血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)在膿毒癥小鼠體內(nèi)的基因和蛋白水平的表達(dá)情況和分泌水平。
　　3.初步探討B(tài)MSCs在膿毒癥早期的治療作用與凝血的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.體外采用全骨髓法分離、純化、擴(kuò)增、培養(yǎng)BMSCs，10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。
　　2.將第五代BM

2、SCs分為對(duì)照組和誘導(dǎo)組，對(duì)照組細(xì)胞按10％FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組細(xì)胞用配制好的細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩組細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)2周后，用油紅染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)是否有脂滴形成。
　　3.117只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）和BMSCs移植組（CLP+BMSCs組），通過盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)制作小鼠膿毒癥模型，制模后6h，CLP+BMSCs組每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射BMSCs懸液（含BM

3、SCs1*106/0.3ml）和CLP組每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.3ml;每6小時(shí)觀察各組小鼠生存情況，作生存曲線圖。
　　4.膿毒癥小鼠干細(xì)胞移植后6、12、24小時(shí)，小鼠麻醉后，通過心臟取血留取血液標(biāo)本經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血漿分泌型血栓調(diào)節(jié)蛋白(sTM)濃度，并留取肺臟標(biāo)本作肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察，提取肺組織RNA和蛋白質(zhì)通過分別實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)TM mRNA和TM蛋白的表達(dá)情況

4、。
　　結(jié)果：
　　1.顯微鏡下可見對(duì)照組小鼠BMSCs胞質(zhì)內(nèi)無明顯變化且未被油紅染色，誘導(dǎo)組小鼠BMSCs胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴并被油紅染色成橙紅色，說明小鼠BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后具有向脂肪細(xì)胞分化的能力。
　　2.CLP組和CLP+BMSCs組小鼠的4天生存率分別為30％和50％，BMSCs移植后膿毒癥小鼠的生存情況明顯得到改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.Sham組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰

5、，肺泡隔及支氣管未見明顯炎細(xì)胞及滲出物，可見少許紅細(xì)胞。與Sha組比較，CLP組小鼠肺組織嚴(yán)重水腫、出血，肺泡壁完整性被破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤;與CLP組比較，CLP+BMSCs組小鼠肺組織損傷明顯減輕，出血、細(xì)胞浸潤等情況明顯改善，并且隨時(shí)間延長肺組織重塑，組織結(jié)構(gòu)越來越清晰。
　　4.與Sham組相比，CLP組血漿中分泌的sTM量在6、12、24小時(shí)都明顯增多，在第12小時(shí)出現(xiàn)sTM的分泌峰值;而CLP+BMSCs組相較于CL

6、P組sTM分泌水平在在12、24h時(shí)間點(diǎn)均有顯著下降趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.各組小鼠肺組織中TM mRNA表達(dá)和TM蛋白免疫組織化學(xué)平均陽性積分光密度值都有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，CLP組水平明顯下降，CLP+BMSCs組顯著升高。TM mRNA在Sham組、CLP組和CLP+BMSCs組小鼠的肺組織中均有表達(dá)。CLP組相較于Sham組TM mRNA表達(dá)水平在干細(xì)胞移植后6、12、24小時(shí)均明顯

7、下降，而CLP+BMSCs組較CLP組顯著升高。CLP組小鼠肺組織TM平均陽性積分光密度值明顯低于Sham組，CLP+BMSCs組TM平均陽性積分光密度值和CLP組比較后可見明顯升高趨勢(shì)，但未表現(xiàn)出隨時(shí)間點(diǎn)的變化而明顯變化。
　　結(jié)論：
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在改善膿毒癥小鼠的生存率和肺臟炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上明顯降低膿毒癥小鼠內(nèi)皮細(xì)胞表面血栓調(diào)節(jié)蛋白的分泌，并且分別在基因和蛋白水平上調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，有可能從凝血方面影響了