骨髓間充質干細胞對膿毒癥小鼠血栓調節(jié)蛋白的影響研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察經(jīng)尾靜脈移植骨髓間充質干細胞(BMSCs)后膿毒癥小鼠的生存情況。
　　2.觀察BMSCs移植后血栓調節(jié)蛋白(TM)在膿毒癥小鼠體內的基因和蛋白水平的表達情況和分泌水平。
　　3.初步探討B(tài)MSCs在膿毒癥早期的治療作用與凝血的相關性。
　　方法：
　　1.體外采用全骨髓法分離、純化、擴增、培養(yǎng)BMSCs，10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，顯微鏡下觀察細胞生長狀況。
　　2.將第五代BM

2、SCs分為對照組和誘導組，對照組細胞按10％FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導組細胞用配制好的細胞成脂誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩組細胞在相同條件下培養(yǎng)2周后，用油紅染色，顯微鏡下觀察細胞胞質內是否有脂滴形成。
　　3.117只雄性ICR小鼠隨機分為假手術組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）和BMSCs移植組（CLP+BMSCs組），通過盲腸結扎穿孔手術制作小鼠膿毒癥模型，制模后6h，CLP+BMSCs組每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射BMSCs懸液（含BM

3、SCs1*106/0.3ml）和CLP組每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.3ml;每6小時觀察各組小鼠生存情況，作生存曲線圖。
　　4.膿毒癥小鼠干細胞移植后6、12、24小時，小鼠麻醉后，通過心臟取血留取血液標本經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血漿分泌型血栓調節(jié)蛋白(sTM)濃度，并留取肺臟標本作肺組織病理形態(tài)學觀察，提取肺組織RNA和蛋白質通過分別實時熒光定量PCR技術和免疫組織化學技術檢測TM mRNA和TM蛋白的表達情況

4、。
　　結果：
　　1.顯微鏡下可見對照組小鼠BMSCs胞質內無明顯變化且未被油紅染色，誘導組小鼠BMSCs胞質內出現(xiàn)大量脂滴并被油紅染色成橙紅色，說明小鼠BMSCs經(jīng)誘導培養(yǎng)后具有向脂肪細胞分化的能力。
　　2.CLP組和CLP+BMSCs組小鼠的4天生存率分別為30％和50％，BMSCs移植后膿毒癥小鼠的生存情況明顯得到改善，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.Sham組小鼠肺組織結構完整，肺泡腔清晰

5、，肺泡隔及支氣管未見明顯炎細胞及滲出物，可見少許紅細胞。與Sha組比較，CLP組小鼠肺組織嚴重水腫、出血，肺泡壁完整性被破壞，大量炎癥細胞浸潤;與CLP組比較，CLP+BMSCs組小鼠肺組織損傷明顯減輕，出血、細胞浸潤等情況明顯改善，并且隨時間延長肺組織重塑，組織結構越來越清晰。
　　4.與Sham組相比，CLP組血漿中分泌的sTM量在6、12、24小時都明顯增多，在第12小時出現(xiàn)sTM的分泌峰值;而CLP+BMSCs組相較于CL

6、P組sTM分泌水平在在12、24h時間點均有顯著下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.各組小鼠肺組織中TM mRNA表達和TM蛋白免疫組織化學平均陽性積分光密度值都有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，CLP組水平明顯下降，CLP+BMSCs組顯著升高。TM mRNA在Sham組、CLP組和CLP+BMSCs組小鼠的肺組織中均有表達。CLP組相較于Sham組TM mRNA表達水平在干細胞移植后6、12、24小時均明顯

7、下降，而CLP+BMSCs組較CLP組顯著升高。CLP組小鼠肺組織TM平均陽性積分光密度值明顯低于Sham組，CLP+BMSCs組TM平均陽性積分光密度值和CLP組比較后可見明顯升高趨勢，但未表現(xiàn)出隨時間點的變化而明顯變化。
　　結論：
　　骨髓間充質干細胞移植在改善膿毒癥小鼠的生存率和肺臟炎癥反應的基礎上明顯降低膿毒癥小鼠內皮細胞表面血栓調節(jié)蛋白的分泌，并且分別在基因和蛋白水平上調血栓調節(jié)蛋白的表達，有可能從凝血方面影響了