異土木香內(nèi)酯抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)制探討.pdf

1、目的：土木香(Inula helenium L.)系菊科旋覆花屬植物，為多年生草本植物，廣泛分布于歐洲、北美洲及東亞等地區(qū)。其根供藥用，具有健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲等功效。目前已從土木香中分離得到土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯(Isoalantolactone)和二氫土木香內(nèi)酯等多種成分，這些成分具有抗腫瘤、抗炎、驅(qū)蟲、抗菌、降血糖和鎮(zhèn)痛等多種生物活性。本實驗以人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(HEC-1)為材料，研究異土木香內(nèi)酯對HEC-1細(xì)胞增殖的抑制作

2、用，并進(jìn)一步探討異土木香內(nèi)酯抑制HEC-1細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))比色法
　　 1.1腫瘤細(xì)胞株懸液制備
　　 用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整HEC-1腫瘤細(xì)胞株濃度為2×105個/ml的細(xì)胞懸液備用。
　　 1.2體外抑瘤實驗
　　 取對數(shù)生長期的HEC-1細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮接種于96孔板，每孔50μL(含1×104個細(xì)胞)，分別加入溶劑對

3、照(終濃度0.1％DMSO)、陽性對照順鉑和終濃度為100μmol/L、101μmol/L和1μmol/L的異土木香內(nèi)酯各50μL，每組均設(shè)3個復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入5mg/mL的MTT10μL。培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入反應(yīng)停止液150μL，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值)，并計算細(xì)胞生存率率，細(xì)胞生存率(％)=(對照組

4、OD值/對照組OD值)×100％。實驗數(shù)據(jù)用The SPSS system V13.0軟件進(jìn)行處理，受試藥物對細(xì)胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計算藥物的IC50值。
　　 2、熒光素酶報告基因檢測
　　 取對數(shù)生長期的HEC-1細(xì)胞，以每孔5×104個細(xì)胞接種于24孔板中，用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次。每孔加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液0.3m

5、L。取500ng熒光素酶報告基因質(zhì)粒pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAI-Luc以及5ng內(nèi)參照基因質(zhì)粒SV-40-Rluc與1.2μg脂質(zhì)體共同加入0.6mL無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，混勻室溫孵育30 min后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)孔中，每孔25μL，于飽和濕度、37℃C和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。棄去轉(zhuǎn)染液，更換10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液0.9 mL，于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2

6、4 h。分別加入含有異土木香內(nèi)酯(終濃度為5μmol/L和101μmol/L)和不含異土木香內(nèi)酯的10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液0.1mL，于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用1×PLB(passive lysisbuffer)裂解細(xì)胞后，立即上機(jī)檢測，記錄報告基因pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAT-Luc熒光素酶與內(nèi)參照基因SV-40-Rluc熒光素酶活性的比值。

7、>　　 3、Western blotting檢測
　　 取對數(shù)生長期的HEC-1細(xì)胞，按2×106個細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種HEC-1細(xì)胞。加入含終濃度為2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L異土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48小時，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入上樣緩沖液100μL，劇烈震蕩后冰浴下超聲波處理1min。100℃加熱10min使蛋白質(zhì)變性，12000r/min離心10min，取上清液測定蛋白濃度。取5

8、0μg蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，用5％脫脂奶粉于室溫下?lián)u動封閉膜2 h。棄封閉液，用1×TBS-T洗膜，15min×3次。膜在抗p53多克隆抗體(1:500)和抗Bax多克隆抗體(1:700)稀釋液中室溫過夜孵育，1×TBS-T洗膜15 min，共3次后，在二抗稀釋液(抗鼠1:5000)中孵育40 min。再次洗膜后加入ECL試劑，反應(yīng)1 min，用X片曝光1～10 min后，顯影。
　　 4、半胱天

9、冬酶抑制劑對異土木香內(nèi)酯抑制HEC-1細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用取對數(shù)生長期的HEC-1細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮接種于96孔板，每孔50μL(含1×104個細(xì)胞)，分別加入含有半胱天冬酶抑制劑(終濃度為20μmol/L)的異土木香內(nèi)酯(終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L)共同孵育HEC-1細(xì)胞和不含半胱天冬酶抑制劑的異土木香內(nèi)酯(終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L)單獨孵育HEC-1細(xì)胞，各5

10、0μL，每組均設(shè)3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入5 mg/mL的MTT10μL。培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入反應(yīng)停止液150μL，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值)，并計算細(xì)胞生存率率，細(xì)胞生存率(％)=(對照組OD值/對照組OD值)×100％。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))比色法結(jié)果
　

11、　 本實驗采用MTT法探討了異土木香內(nèi)酯對HEC-1細(xì)胞增殖活性的影響。順鉑和異土木香內(nèi)酯對HEC-1細(xì)胞的增殖顯示強(qiáng)的抑制活性，1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的順鉑和異土木香內(nèi)酯處理的HEC-1細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為79.16％、51.23％、24.54％和63.96％、34.67％、13.96％，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系，與空白對照組相比具有非常顯著性(P<0.01)和顯著性(P<0.05)的差異，IC50

12、分別為11.32μmol/L和4.16μmol/L。
　　 2、異土木香內(nèi)酯對HEC-1細(xì)胞內(nèi)pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAT-Luc的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 使用10μmol/L的異土木香內(nèi)酯處理HEC-1細(xì)胞后，觀察其對HEC-1細(xì)胞報告基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，異土木香內(nèi)酯可明顯誘導(dǎo)HEC-1細(xì)胞內(nèi)pGBax-Luc的表達(dá)，對p53的報告基因PG13-Luc、與NF-κB的報告基因IgK-Lu

13、c以及與NFAT的報告基因NFAT-Luc則不顯示誘導(dǎo)活性(圖2 A和B)。
　　 3、異土木香內(nèi)酯對HEC-1細(xì)胞內(nèi)P53和Bax蛋白的上調(diào)作用
　　 為了進(jìn)一步探討異土木香內(nèi)酯對HEC-1細(xì)胞內(nèi)P53和Bax蛋白的影響，使用異土木香內(nèi)酯處理HEC-1細(xì)胞48小時后，通過Western blotting方法檢測細(xì)胞內(nèi)P53和Bax蛋白的變化。結(jié)果異土木香內(nèi)酯作用HEC-1細(xì)胞48小時后，細(xì)胞內(nèi)的P53和Bax蛋白表達(dá)顯

14、著上調(diào)(圖2C)。
　　 4、半胱天冬酶抑制劑對異土木香內(nèi)酯抑制HEC-1細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用使用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的異土木香內(nèi)酯處理HEC-1細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為63.96％、34.67％和13.96％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與土木香內(nèi)酯共同孵育HEC-1細(xì)胞后，其細(xì)胞生存率分別上升為81.91％、56.05％和52.15％。
　　 結(jié)論：異土木香內(nèi)酯能顯著抑制HEC