ITGB1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:生信數(shù)據(jù)分析腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)
　　目的:篩選在激活Notch信號(hào)通路中具有關(guān)鍵作用的基因。
　　方法:在GCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩選芯片數(shù)據(jù)，選擇芯片表達(dá)譜進(jìn)行Pathway、GeneOntology和基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。
　　結(jié)果:1、差異性基因表達(dá)譜:通過(guò)檢索GCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GSE22772芯片數(shù)據(jù)，篩選出表達(dá)倍數(shù)變化＞1.1倍的基因有7962條。2、信號(hào)通路顯著性分析:干擾Delte

2、x-1表達(dá)后，得到Deltex-1介導(dǎo)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路，本研究篩選最顯著的10個(gè)信號(hào)通路。GO基因富集分析顯示，Deltex-1功能多樣，調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，本研究篩選出10個(gè)相關(guān)性最強(qiáng)的基因功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析。3、對(duì)差異基因表達(dá)譜、顯著性基因功能和顯著性信號(hào)通路取交集，找到既參與了顯著功能又參與了顯著信號(hào)通路的靶基因ITGB1，構(gòu)建其與其他靶基因之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)論:在GSE22772表達(dá)譜中篩選出差異

3、性表達(dá)基因，通過(guò)GO分析和基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)ITGB1可能在激活Notch信號(hào)通路中具有重要作用。
　　第二部分:ITGB1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系
　　目的:在膠質(zhì)瘤標(biāo)本和瘤周正常組織檢測(cè)ITGB1的表達(dá)水平;分析ITGB1與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系;分析ITGB1的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:1、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組化分別檢測(cè)ITGB1在臨床膠質(zhì)瘤腫瘤組織和瘤周正常組織中的mRNA和蛋白

4、的表達(dá)水平;2、回顧病例并隨訪(fǎng)，利用Kaplan-Meier曲線(xiàn)分析ITGB1在的表達(dá)差異與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:1、ITGB1 mRNA在24對(duì)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中平均表達(dá)水平高于瘤周正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果同qRT-PCR結(jié)果一致，ITGB1蛋白在腫瘤組織中表達(dá)量顯著高于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2、通過(guò)篩選并隨訪(fǎng)43例患者，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)ITGB1的患者生存時(shí)間較

5、長(zhǎng)，高表達(dá)ITGB1的患者生存時(shí)間較短，ITGB1和膠質(zhì)瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:ITGB1在膠質(zhì)瘤組織中顯著高表達(dá)，并且與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物，指導(dǎo)臨床診療工作。
　　第三部分:ITGB1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖行為的影響及與Notch信號(hào)通路之間的關(guān)系
　　目的:探討ITGB1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖行為的影響及其與Notch信號(hào)通路之間的關(guān)系。
　　方法:1、利用實(shí)時(shí)熒光定量P

6、CR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251、SHG44、U373、U87、T98G)中ITGB1的mRNA表達(dá)水平，選取表達(dá)水平最低和最高的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);2、利用慢病毒在U87細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染sh-ITGB1質(zhì)粒以干擾ITGB1表達(dá)，在U251細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染oe-ITGB1質(zhì)粒以過(guò)表達(dá)ITGB1;3、干擾和過(guò)表達(dá)ITGB1后，利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力變化;4、干擾和過(guò)表達(dá)ITGB1后，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成能力變化;

7、5、干擾和過(guò)表達(dá)ITGB1后，利用Western blot檢測(cè)Notch及其通路下游蛋白Hey1蛋白表達(dá)水平變化，進(jìn)一步探索ITGB1與Notch通路的關(guān)系。
　　結(jié)果:1、ITGB1在五種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中均有mRNA表達(dá)，其中U87細(xì)胞株中ITGB1的mRNA表達(dá)量最高，U251細(xì)胞株中ITGB1的mRNA表達(dá)量最低。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇U87進(jìn)行干擾ITGB1的表達(dá)，選擇U251進(jìn)行ITGB1的過(guò)表達(dá)。2、在U87細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染sh

8、-ITGB1，U251轉(zhuǎn)染oe-ITGB1后，熒光顯微鏡觀(guān)察到sh-ITGB1和oe-ITGB1在U87、U251中轉(zhuǎn)染效率良好。qRT-PCR及Western blot檢測(cè)ITGB1在分別在U251、U87細(xì)胞中的mRNA及蛋白成功過(guò)表達(dá)或被干擾;驗(yàn)證ITGB1蛋白在U251中表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05)、U87細(xì)胞表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、MTT實(shí)驗(yàn)顯示干擾ITGB1后，顯著抑制U87的增殖能力，過(guò)表達(dá)I

9、TGB1后，顯著促進(jìn)U251的增殖能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4、克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示干擾ITGB1后，顯著抑制U87的克隆形成能力，過(guò)表達(dá)ITGB1后，顯著促進(jìn)U251的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5、ITGB1下調(diào)后，Nocth蛋白和Hey1蛋白表達(dá)也出現(xiàn)顯著下調(diào)(P＜0.05);過(guò)表達(dá)ITGB1則顯著上調(diào)了Notch蛋白(P＜0.05)和Hey1蛋白(P＜0.05)。
　　結(jié)論:ITGB1能顯