ITGB1促進膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用和機制研究.pdf

1、第一部分:生信數(shù)據(jù)分析腦膠質(zhì)瘤細胞中Notch信號通路相關(guān)基因表達
　　目的:篩選在激活Notch信號通路中具有關(guān)鍵作用的基因。
　　方法:在GCBI數(shù)據(jù)庫篩選芯片數(shù)據(jù)，選擇芯片表達譜進行Pathway、GeneOntology和基因共表達網(wǎng)絡分析。
　　結(jié)果:1、差異性基因表達譜:通過檢索GCBI數(shù)據(jù)庫獲得GSE22772芯片數(shù)據(jù)，篩選出表達倍數(shù)變化＞1.1倍的基因有7962條。2、信號通路顯著性分析:干擾Delte

2、x-1表達后，得到Deltex-1介導調(diào)節(jié)多個信號通路，本研究篩選最顯著的10個信號通路。GO基因富集分析顯示，Deltex-1功能多樣，調(diào)控細胞凋亡、細胞周期、信號轉(zhuǎn)導等，本研究篩選出10個相關(guān)性最強的基因功能進行生物信息學分析。3、對差異基因表達譜、顯著性基因功能和顯著性信號通路取交集，找到既參與了顯著功能又參與了顯著信號通路的靶基因ITGB1，構(gòu)建其與其他靶基因之間的關(guān)系網(wǎng)絡。
　　結(jié)論:在GSE22772表達譜中篩選出差異

3、性表達基因，通過GO分析和基因共表達網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)ITGB1可能在激活Notch信號通路中具有重要作用。
　　第二部分:ITGB1在膠質(zhì)瘤組織中的表達及與患者預后的關(guān)系
　　目的:在膠質(zhì)瘤標本和瘤周正常組織檢測ITGB1的表達水平;分析ITGB1與膠質(zhì)瘤病理分級的關(guān)系;分析ITGB1的表達與預后的關(guān)系。
　　方法:1、利用實時熒光定量PCR及免疫組化分別檢測ITGB1在臨床膠質(zhì)瘤腫瘤組織和瘤周正常組織中的mRNA和蛋白

4、的表達水平;2、回顧病例并隨訪，利用Kaplan-Meier曲線分析ITGB1在的表達差異與膠質(zhì)瘤患者預后的關(guān)系。
　　結(jié)果:1、ITGB1 mRNA在24對膠質(zhì)瘤組織標本中平均表達水平高于瘤周正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫組織化學結(jié)果同qRT-PCR結(jié)果一致，ITGB1蛋白在腫瘤組織中表達量顯著高于正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。2、通過篩選并隨訪43例患者，發(fā)現(xiàn)低表達ITGB1的患者生存時間較

5、長，高表達ITGB1的患者生存時間較短，ITGB1和膠質(zhì)瘤的預后呈負相關(guān)。
　　結(jié)論:ITGB1在膠質(zhì)瘤組織中顯著高表達，并且與患者的生存時間呈負相關(guān)，可作為預測患者預后的潛在生物標記物，指導臨床診療工作。
　　第三部分:ITGB1對腦膠質(zhì)瘤細胞增殖行為的影響及與Notch信號通路之間的關(guān)系
　　目的:探討ITGB1對膠質(zhì)瘤細胞的增殖行為的影響及其與Notch信號通路之間的關(guān)系。
　　方法:1、利用實時熒光定量P

6、CR檢測膠質(zhì)瘤細胞株(U251、SHG44、U373、U87、T98G)中ITGB1的mRNA表達水平，選取表達水平最低和最高的細胞株進行后續(xù)實驗;2、利用慢病毒在U87細胞株中轉(zhuǎn)染sh-ITGB1質(zhì)粒以干擾ITGB1表達，在U251細胞株中轉(zhuǎn)染oe-ITGB1質(zhì)粒以過表達ITGB1;3、干擾和過表達ITGB1后，利用MTT實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力變化;4、干擾和過表達ITGB1后，利用克隆形成實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞的克隆形成能力變化;

7、5、干擾和過表達ITGB1后，利用Western blot檢測Notch及其通路下游蛋白Hey1蛋白表達水平變化，進一步探索ITGB1與Notch通路的關(guān)系。
　　結(jié)果:1、ITGB1在五種膠質(zhì)瘤細胞株中均有mRNA表達，其中U87細胞株中ITGB1的mRNA表達量最高，U251細胞株中ITGB1的mRNA表達量最低。在后續(xù)實驗中，選擇U87進行干擾ITGB1的表達，選擇U251進行ITGB1的過表達。2、在U87細胞株中轉(zhuǎn)染sh

8、-ITGB1，U251轉(zhuǎn)染oe-ITGB1后，熒光顯微鏡觀察到sh-ITGB1和oe-ITGB1在U87、U251中轉(zhuǎn)染效率良好。qRT-PCR及Western blot檢測ITGB1在分別在U251、U87細胞中的mRNA及蛋白成功過表達或被干擾;驗證ITGB1蛋白在U251中表達量上調(diào)(P＜0.05)、U87細胞表達量顯著下調(diào)(P＜0.05)，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異。3、MTT實驗顯示干擾ITGB1后，顯著抑制U87的增殖能力，過表達I

9、TGB1后，顯著促進U251的增殖能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。4、克隆形成實驗顯示干擾ITGB1后，顯著抑制U87的克隆形成能力，過表達ITGB1后，顯著促進U251的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。5、ITGB1下調(diào)后，Nocth蛋白和Hey1蛋白表達也出現(xiàn)顯著下調(diào)(P＜0.05);過表達ITGB1則顯著上調(diào)了Notch蛋白(P＜0.05)和Hey1蛋白(P＜0.05)。
　　結(jié)論:ITGB1能顯