黃葵素對(duì)DN大鼠模型及腎系膜細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:1.從分子、細(xì)胞及動(dòng)物模型水平多層次探討糖尿病腎病背景下腎臟局部NF-κB通路激活，及其對(duì)糖尿病腎病的影響。2.評(píng)估黃葵素降低蛋白尿的作用，明確其對(duì)NF-κB通路與下游炎癥因子的影響。
　　材料和方法:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖腎對(duì)照組、陽性藥對(duì)照組(厄貝沙坦12mg/Kg)以及不同劑量黃葵素治療組(75mg/Kg/d、135mg/Kg/d、300mg/Kg/d)，正常對(duì)照組10只，其余各組40只。選擇

2、高糖高脂飲食結(jié)合低劑量鏈脲菌素(STZ)誘導(dǎo)SD大鼠制備DM模型，該模型早期表現(xiàn)為高血糖，后期出現(xiàn)蛋白尿等DN表現(xiàn)，體現(xiàn)了DM進(jìn)行性腎損害的特點(diǎn)。DN成模后，所有藥物均灌胃給藥，正常對(duì)照組、糖腎對(duì)照組每日接受等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥8周后收集標(biāo)本，ELISA法檢測(cè)大鼠血清及腎組織TNF-α、 IL-1β和IL-6表達(dá)水平;免疫組化檢測(cè)腎組織NF-κB的表達(dá)水平;Western-blot檢測(cè)腎組織細(xì)胞核的NF-κB p65蛋白表達(dá)水平;

3、Q-PCR檢測(cè)腎組織NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn):將大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)分為空白血清組、TNF-α組、藥物血清加TNF-α組。體外培養(yǎng)24小時(shí)，加入血清36h后，加入濃度為10ng/ml的TNF-α誘導(dǎo)損傷12h，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)大鼠腎系膜細(xì)胞中NF-κB p65轉(zhuǎn)錄水平;ELISA法驗(yàn)證上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1

4、.藥物干預(yù)各組均能延緩大鼠體重下降，與糖腎組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。黃葵素高劑量組及厄貝沙坦組可顯著改善DN大鼠的血糖，降低尿ACR，與糖腎組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2.ELISA結(jié)果示，與糖腎組相比，黃葵素中劑量組可顯著降低DN大鼠血清中TNF-α水平，腎組織中IL-6的分泌水平(P＜0.05);黃葵素高劑量組可抑制DN大鼠血清和腎組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、(P＜0.05);厄貝沙坦組可顯著降低血清及腎組織中IL-6、IL-1β的分泌水平，血清中TNF-α的水平也得到抑制，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3.Q-PCR結(jié)果示，與糖腎模型組比較，藥物干預(yù)各組腎組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平均有所下降，黃葵素高劑量組、厄貝沙坦組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。4.免疫組化結(jié)果示，藥物干預(yù)各組腎組織細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)水平均有下降，其中黃葵素高劑量組

6、及厄貝沙坦組與糖腎組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5.WesternBlot結(jié)果示藥物干預(yù)后各組腎組織細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平均有下降，但總mRNA表達(dá)水平與與糖腎組比較，無明顯差異(P＞0.05)。6.大鼠腎系膜細(xì)胞胞內(nèi)luciferase assay實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)活性上調(diào)，而經(jīng)過含有黃葵素血清處理的細(xì)胞內(nèi)，此上調(diào)趨勢(shì)受到顯著抑制，經(jīng)含藥血清處理的GMC細(xì)胞上清液中，T