激活肝X受體對改善慢性腦缺血小鼠認(rèn)知障礙的機(jī)制研究和天麻素對CFA誘導(dǎo)炎性痛小鼠行為學(xué)的影響.pdf

1、第一部分
　　背景：慢性腦缺血（Chronic cerebral hypoperfusion,CCH）為臨床常見病、多發(fā)病，致死率、致殘率高，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重危害人類健康。迄今為止，CCH導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)理不完全清楚，尚無特效藥物和治療手段，因此，CCH導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制與防治是神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　CCH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要的病理過程包括缺血導(dǎo)致細(xì)胞能量缺失、細(xì)胞壞死和凋亡、腦白質(zhì)損傷、血腦屏障

2、破壞、脂質(zhì)代謝和神經(jīng)血管單元功能紊亂，神經(jīng)發(fā)生受損等。神經(jīng)發(fā)生即新的神經(jīng)元產(chǎn)生的過程，包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化，最終新生成的神經(jīng)元并整合到局部神經(jīng)環(huán)路。臨床上中風(fēng)患者數(shù)周至數(shù)月后癥狀有所改善，部分得益于腦部這種內(nèi)在的修復(fù)機(jī)制，因此促進(jìn)腦缺血損傷后的神經(jīng)發(fā)生對其治療有重要意義。當(dāng)腦組織受到損傷或炎癥等刺激時(shí)，局部微環(huán)境發(fā)生改變，神經(jīng)干細(xì)胞即被活化，進(jìn)而增殖、遷移、分化產(chǎn)生新的神經(jīng)元，發(fā)揮代償和修復(fù)功能。
　　眾多因素影響CC

3、H時(shí)的神經(jīng)發(fā)生，其中核受體超家族重要成員——肝X受體（Liver X receptors,LXRs），在神經(jīng)發(fā)生中的地位日益受到關(guān)注。LXRs包括兩種亞型——LXRα和LXRβ。LXRα主要表達(dá)在肝臟、腎臟、小腸、脾臟、脂肪組織等參與外周脂質(zhì)代謝的器官；LXRβ表達(dá)十分廣泛，其中肝臟和大腦的表達(dá)水平最高。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system,CNS）中，LXRs是最主要的維持膽固醇平衡和抗炎的因子。膽固醇代謝失調(diào)參

4、與眾多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病，尤其在CCH發(fā)生發(fā)展的過程扮演重要角色，通過調(diào)節(jié)或糾正脂質(zhì)代謝紊亂，有可能用于CCH的臨床治療。研究表明，LXRα和LXRβ作為抗炎轉(zhuǎn)錄因子，參與先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，亦可作為細(xì)胞凋亡和吞噬的生理調(diào)節(jié)劑。來自細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜破裂的膽固醇衍生物，作為LXRs激動(dòng)劑發(fā)揮抗凋亡的作用。已有研究證實(shí)，LXRs受體激動(dòng)劑GW3965可劑量依賴性地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，提示LXRs可能參與了神經(jīng)發(fā)生，推測可能在改善CC

5、H導(dǎo)致的認(rèn)知障礙中也發(fā)揮著重要的作用。因此，LXRs可能作為CCH潛在的治療新靶點(diǎn)具有非常重要的意義。
　　目的：以腦內(nèi)LXRs為研究對象，探討LXRs參與CCH的發(fā)病機(jī)制、激活LXRs改善CCH引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的分子機(jī)制。擬通過闡明LXRs激動(dòng)劑GW3965提高神經(jīng)元的存活、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，從而改善CCH引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的研究機(jī)制。該研究為治療CCH提供新靶點(diǎn)，為臨床研究提供思路和理論依據(jù)。
　　方法：
　

6、　1.免疫熒光法觀察LXRα、LXRβ在海馬是否有特異性表達(dá)、分布；進(jìn)一步通過LXRβ與神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（NeuN/GFAP）雙標(biāo)共染確定LXRs分布的細(xì)胞特異性，將LXRβ與抑制性/興奮性神經(jīng)元標(biāo)志物（GABA/VGLUT2）雙標(biāo)染色確定表達(dá)的神經(jīng)元類型。
　　2.微彈簧圈法造成雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄（Bilateral carotid stenosis,BCAS）建立CCH小鼠模型；Morris水迷宮行為學(xué)評價(jià)CCH是否能夠?qū)е?/p>

7、小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，進(jìn)而給予GW3965治療15d是否可改善CCH導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　3.給予或不給予GW3965治療，觀察HE染色小鼠的PFC（Prefrontal cortex）、CA1區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)、存活率變化。
　　4.采用Western blot的方法，檢測CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRs不同亞型表達(dá)水平的變化。
　　5.采用Western blot的方法，檢測該模型小鼠腦內(nèi)谷氨酸離子型受體

8、與凋亡信號(hào)通路上相關(guān)蛋白表達(dá)的變化；并觀察給予GW3965治療后是否逆轉(zhuǎn)這些蛋白的表達(dá)。
　　6.體外培養(yǎng)神經(jīng)元，建立氧糖剝奪模型（OGD）模擬CCH模型，利用MTT檢測不同時(shí)間梯度CoCl2對細(xì)胞存活率的影響，以及給予不同濃度梯度GW3965細(xì)胞存活率的變化。
　　7.BrdU摻入（100mg/kg i.p，連續(xù)3d）、染色法觀察CCH建模30d小鼠海馬齒狀回（DG）區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的變化，給予GW3965治療CCH小鼠，

9、DG區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的變化。
　　8.體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，首先采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察LXRα、LXRβ與神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin是否共表達(dá)；并觀察給予不同濃度梯度GW3965處理后是否會(huì)濃度依賴性的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
　　9.設(shè)計(jì)并包裝生產(chǎn)LXRα、LXRβ慢病毒載體（shLXRα、shLXRβ）；通過免疫熒光和Western blot驗(yàn)證shLXRα、shLXRβ體外感染神經(jīng)干細(xì)胞的效率及下調(diào)LXRα、LXRβ表達(dá)

10、水平的效果；
　　10.shLXRα、shLXRβ、shLXRα+shLXRβ分別感染NSCs72h后，給予GW3965處理3d，經(jīng)BrdU（100μg/ml,4h）摻入后免疫熒光染色法分析細(xì)胞增殖的變化，明確GW3965促NSCs增殖效應(yīng)的LXRs受體亞型。
　　11.為探究PI3K/Akt信號(hào)通路在GW3965促NSCs增殖中的作用，首先Western blot法觀察GW3965對NSCs中Akt磷酸化的影響（時(shí)間依賴性

11、和濃度依賴性）；進(jìn)而預(yù)先給予PI3K特異性抑制劑LY294002（20μM,2h）處理，觀察GW3965對p-Akt表達(dá)水平的影響；最后，BrdU摻入法分析LY294002對GW3965促NSCs增殖效應(yīng)的影響，明確GW3965是否通過PI3K/Akt信號(hào)通路促NSCs增殖效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光染色結(jié)果顯示，LXRβ海馬區(qū)的表達(dá)多，LXRα在海馬區(qū)表達(dá)較少。
　　2.Morris水迷宮結(jié)果顯示，與假手術(shù)組

12、相比，CCH導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為小鼠搜索平臺(tái)時(shí)間（潛伏期）延長，游泳距離增加，穿越平臺(tái)次數(shù)減少；與模型組相比，GW3965治療后，顯著改善CCH導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　3.HE染色結(jié)果證實(shí)，與假手術(shù)組相比，模型小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)不清晰，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮和大量細(xì)胞凋亡；與模型組相比，給予GW3965治療后神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)與正常相似，細(xì)胞凋亡的比例下降。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與

13、假手術(shù)組相比，CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRβ表達(dá)水平顯著下調(diào)，LXRα表達(dá)水平的變化不明顯。
　　5.Western blot結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，CCH模型小鼠海馬中谷氨酸離子型受體——NMDAR的亞基GluN2B表達(dá)水平增加而GluN2A基本不變，AMPAR的GluR1亞基絲氨酸831、845位點(diǎn)磷酸化減少，同時(shí)，凋亡信號(hào)通路中Bax、PARP表達(dá)增加而Bcl-2表達(dá)下降；給予CCH小鼠GW3965治療后，可以逆轉(zhuǎn)

14、上述這些蛋白表達(dá)的變化。
　　6.以CoCl2（200μM）孵育培養(yǎng)的神經(jīng)元模擬氧糖剝奪病理?xiàng)l件，MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CoCl2干預(yù)后神經(jīng)元存活呈時(shí)間依賴性降低，大約50％細(xì)胞于缺氧12h時(shí)死亡；給GW3965處理后發(fā)現(xiàn)，GW3965濃度依賴性提高細(xì)胞的存活。
　　7.采用BrdU摻入免疫熒光染色法分析NSCs的增殖，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CCH小鼠DG區(qū)BrdU陽性的NSCs數(shù)目顯著減少，提示CCH中NSCs增殖受損；

15、給予GW3965治療后，與CCH組相比，GW3965恢復(fù)CCH小鼠DG區(qū)NSCs的增殖，提示GW3965具有促NSCs增殖的作用。
　　8.體外培養(yǎng)NSCs，免疫熒光雙標(biāo)法觀察NSCs中LXRα、LXRβ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LXRα、LXRβ與NSCs標(biāo)志物Nestin共存；給予不同濃度LXRs的激動(dòng)劑GW3965處理，發(fā)現(xiàn)GW3965濃度依賴性的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
　　9.包裝生產(chǎn)LXRα/LXRβ的慢病毒載體；免疫熒光和Wes

16、tern blot顯示，shLXRα、shLXRβ高效感染神經(jīng)干細(xì)胞，并顯著下調(diào)LXRα、LXRβ表達(dá)水平。
　　10.分別以shLXRα、shLXRβ感染NSCs下調(diào)蛋白表達(dá)水平，采用BrdU摻入熒光染色法發(fā)現(xiàn)，如前給予GW3965處理3d后，shLXRβ轉(zhuǎn)染后GW3965促NSCs增殖效應(yīng)被取消，而shLXRα轉(zhuǎn)染后不影響GW3965促NSCs增殖作用，提示GW3965促NSCs增殖效應(yīng)通過激活LXRβ而非LXRα實(shí)現(xiàn)。

17、>　　11.Western blot結(jié)果顯示，GW3965時(shí)間、濃度依賴性增加NSCs中Akt磷酸化水平，其中GW3965刺激NSCs15min（10μM）或10μM（15min）時(shí)，Akt的磷酸化即達(dá)高峰；給予NSCs預(yù)處理LY294002（20μM）2h，GW3965磷酸化Akt的效應(yīng)則消失，相應(yīng)的GW3965促NSCs增殖作用亦被取消，提示GW3965促進(jìn)NSCs增殖的效應(yīng)與PI3K/Akt信號(hào)通路活化相關(guān)。
　　結(jié)論：本研

18、究證實(shí)，通過微彈簧造成雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄成功建立小鼠CCH模型，CCH導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙；給予CCH小鼠GW3965治療，可改善CCH小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。深入的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，GW3965通過抑制凋亡信號(hào)通路提高神經(jīng)元的存活；同時(shí)，GW3965通過激活LXRβ，進(jìn)而活化PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)NSCs增殖參與CCH神經(jīng)發(fā)生。研究結(jié)果提示，激活LXRs提高CCH發(fā)生發(fā)展過程中神經(jīng)元的存活、促進(jìn)NSCs增殖，從而改善CCH導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙

19、。因此，LXRs可能作為CCH潛在的治療新靶點(diǎn)。
　　第二部分
　　背景：慢性炎性痛（Chronic inflammatory pain）是一種與組織損傷或潛在的損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情感體驗(yàn)，能夠誘發(fā)不良情緒，使患者的病情加重。研究證實(shí)，前扣帶皮層（Anterior cingulate cortex,ACC）是大腦的疼痛處理區(qū)之一，是痛覺調(diào)節(jié)的重要組成部分。已證實(shí)，慢性痛潛在的機(jī)制包括 ACC區(qū)神經(jīng)元過度興奮以及膠質(zhì)

20、細(xì)胞的激活，其中，膠質(zhì)細(xì)胞的激活導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)反應(yīng)是誘發(fā)慢性痛的重要原因。天麻素（Gastrodin,GAS）是從天麻中分離出的主要活性成分之一，具有鎮(zhèn)痛、促智、抗炎作用。因此，GAS可能作為慢性炎性痛潛在的治療藥物具有非常重要的意義。
　　目的：GAS對改善CFA誘發(fā)慢性炎性痛小鼠行為學(xué)的影響，擬通過闡明GAS改善CFA引起的慢性炎性痛及具有抗焦慮效應(yīng)，抑制炎癥信號(hào)蛋白的過表達(dá)，從而發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用的研究機(jī)制。為臨床治療慢性炎性痛

21、提供思路和理論依據(jù)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)通過檢測機(jī)械痛閾值與熱痛閾值，觀察給予GAS后CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛小鼠的行為學(xué)變化。高架十字迷宮（Elevated plus-maze test,EPM）和曠場實(shí)驗(yàn)（Open field test,OFT）檢測給予GAS后，慢性炎性痛誘導(dǎo)的焦慮樣行為的改變。免疫熒光觀察小鼠ACC區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況，Western blot觀察ACC區(qū)神經(jīng)可塑性蛋白與炎性相關(guān)的蛋白表達(dá)變化。

22、
　　結(jié)果：GAS能顯著緩解CFA誘導(dǎo)的小鼠慢性炎性痛和伴隨的焦慮樣行為。GAS治療后，降低CFA小鼠ACC區(qū)NMDAR亞基GluN2A與GluN2B、AMPAR亞基GluR1及CaMKII-α表達(dá)的上調(diào)，提示與神經(jīng)可塑性相關(guān)的關(guān)鍵分子參與慢性炎性痛及其伴隨的焦慮樣行為。此外，GAS減少CFA小鼠ACC區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低與炎癥相關(guān)信號(hào)蛋白p-JNK和p-P38，IL-6和TNF-α的表達(dá)，提示GAS可能通過調(diào)控