慢性腦缺血大鼠認(rèn)知障礙與腦甲狀腺激素代謝關(guān)系研究.pdf

1、研究背景 血管性癡呆(VD)是老年期癡呆的主要類型之一。在我國(guó)，其患病率僅次于Alzheimer病，缺血性病變尤其多發(fā)性腦梗塞是VD的主要病理基礎(chǔ)，VD可由于主要腦動(dòng)脈閉塞引起腦梗死，梗死腦組織容積超過(guò)80-150ml(包括多發(fā)性腦梗塞)臨床即可出現(xiàn)癡呆，額葉、顳葉及邊緣系統(tǒng)等部位血管源性病變更易導(dǎo)致癡呆。資料顯示60歲以上缺血性卒中患者3個(gè)月后癡呆發(fā)生率較正常人群增高9倍。腔隙性腦梗死患者有83％出現(xiàn)認(rèn)知和行為功能減退，相對(duì)一

2、般人群中認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率為5.3％，增加了15.7倍。另外，國(guó)內(nèi)外已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，慢性腦缺血會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶等行為學(xué)及海馬病理等改變：雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后30d，海馬錐體細(xì)胞密度減低，術(shù)后60d，核固縮深染，海馬錐體細(xì)胞密度顯著減低。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠存活30d時(shí)，經(jīng)水迷宮測(cè)試出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙；60d后，學(xué)習(xí)記憶能力仍然降低，沒(méi)有恢復(fù)的趨勢(shì)。另有研究顯示頸動(dòng)脈狹窄造成的腦血流慢性失代償或腦結(jié)構(gòu)損害可引起認(rèn)知障礙，對(duì)

3、嚴(yán)重頸動(dòng)脈狹窄患者行頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后，其認(rèn)知功能有所恢復(fù)。VD的發(fā)病機(jī)制一直在不斷的探索中。多項(xiàng)研究證明成年個(gè)體需要中、高水平的循環(huán)甲狀腺激素水平來(lái)維持其最佳腦功能狀態(tài)。在正常成年人血清中T4濃度是T3濃度的近50倍，而腦中T3濃度卻與T4濃度基本相平。同樣老年人的腦比外周組織需要更多的T4以完成其代謝。有學(xué)者研究正常甲狀腺功能的老年病人其認(rèn)知功能變化與甲狀腺激素水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血清低T4水平者認(rèn)知功能下降的可能性為相對(duì)高T4水平者的

4、雙倍；老年甲狀腺功能減退患者往往伴有認(rèn)知功能障礙，用外源性甲狀腺激素替代治療后，其甲狀腺功能及認(rèn)知功能均得到改善。最近一項(xiàng)研究證實(shí)亞臨床甲減患者經(jīng)甲狀腺激素替代治療后其韋氏記憶量表測(cè)評(píng)分值有明顯增高；成年甲減時(shí)大鼠海馬LTP產(chǎn)生不能，以及大鼠和人學(xué)習(xí)和記憶損害。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TH通過(guò)對(duì)NRl和NR2BmRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)影響LTP的產(chǎn)生，進(jìn)而影響認(rèn)知功能；可以認(rèn)為認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與甲狀腺激素代謝紊亂有一定聯(lián)系。測(cè)定腦梗塞患者腦脊液TH發(fā)

5、現(xiàn)：CSFFT3、FT4均顯著下降，臨床研究發(fā)現(xiàn)VD患者存在血清甲狀腺激素水平異常，主要表現(xiàn)為低T3綜合征，且其變化與癡呆程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立大鼠慢性腦供血不足模型，研究慢性腦缺血大鼠腦組織甲狀腺激素代謝變化特點(diǎn)，為系統(tǒng)性研究慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能改變與甲狀腺激素系統(tǒng)變化的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)支持，為臨床VD的治療提供新的思路。 研究方法 第一部分慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能行為測(cè)試 一.實(shí)驗(yàn)分組

6、：37只雄性成年SD大鼠隨機(jī)分四組：假手術(shù)組；單純手術(shù)組(永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈5周)；術(shù)后給藥組(雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后次日給予甲狀腺素20mg/日/只灌胃共5周)；甲狀腺機(jī)能減低組(含0.15％PTU的低碘飼料喂養(yǎng)8周)。 二.Morris水迷宮測(cè)試：各組均于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行定位航行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)及工作記憶測(cè)試。 三.統(tǒng)計(jì)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的隨機(jī)方差分析(one-wayANO

7、VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組之間相關(guān)測(cè)試指標(biāo)差異。 第二部分慢性腦缺血大鼠腦組織甲狀腺激素代謝變化 一.實(shí)驗(yàn)分組：假手術(shù)組8只，單純手術(shù)組6只，術(shù)后給藥組6只，甲減組8只。 二.放射免疫法測(cè)定腦組織T3、T4、rT3 1.腦勻漿的制備：于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)大鼠斷頭取腦，除去表面腦膜及血管，稱重，按1∶2比例與PB混合，冰水浴中剪碎，于預(yù)冷的勻漿器中5分種內(nèi)制成組織勻漿。 2.腦組織T3、T4、rT3的提取

8、及純化：取0.4G腦組織勻漿按比例加入95％乙醇，振搖，4℃靜置，離心取上清，室溫下經(jīng)AmberliteCG-400層析柱，通過(guò)醋酸鹽緩沖液的PH梯度、醋酸的濃度梯度，與乙醇的交互作用凈化提純腦組織中的T3、T4、rT3。 3.放射免疫法測(cè)定腦組織T3、T4、rT3：按照試劑盒說(shuō)明操作，以125I多探頭γ計(jì)數(shù)器分別測(cè)各管放射性計(jì)數(shù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 三.放射免疫法測(cè)定腦組織T4-5'-脫碘酶活性 腦組織勻漿離心取

9、上清，分為測(cè)試管與對(duì)照管各400μL，各加入磷酸鹽緩沖液500μL，前者加入L-T4并放入37℃恒溫箱120分鐘充分作用，后者為放入恒溫箱作用后再加入L-T4,95％乙醇2ml中止反應(yīng)，離心取上清，放射免疫法分別測(cè)定T3。并按公式：T4-5'-脫碘酶活性=(測(cè)試管T3量nmol/1-對(duì)照管T3量nmol/1)×3×650.97×0.769，計(jì)算脫碘酶活性。(3為測(cè)試管和對(duì)照管容積3ml，650.97為T(mén)3分子量，0.769為1/0.13

10、×5×2，其中0.13為組織量(g-eq)，5為加入的T4量(μg)，2為作用時(shí)間。) 四.統(tǒng)計(jì)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的隨機(jī)方差分析(one-wayANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)一步分析采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，比較各組之間相關(guān)測(cè)試指標(biāo)差異。 研究結(jié)果 第一部分行為學(xué)測(cè)試 一.定位航行試驗(yàn)：假手術(shù)組6.19±3.90，甲減組9.70±4.87，單純手術(shù)組

11、57.87±57.48，術(shù)后給藥組16.13±19.50；單純手術(shù)組之潛伏期較其它各組明顯延長(zhǎng)，差異具有顯著性(p＜0.05)，其余各組之間無(wú)明顯差異。 二.空間探索試驗(yàn)：假手術(shù)組32.18±7.17，甲減組29.60±4.13，單純手術(shù)組18.50±3.05，術(shù)后給藥組20.58±7.99；甲減組與假手術(shù)組之間無(wú)顯著性差異，單純手術(shù)組和術(shù)后給藥組之間亦無(wú)顯著性差異，而其余各組之間差異具有顯著性(p＜0.05)。 三.工

12、作記憶：假手術(shù)組5.78±3.27，甲減組8.43±4.52，單純手術(shù)組62.84±50.26，術(shù)后給藥組12.65±12.79；假手術(shù)組、甲減組和術(shù)后給藥組之間無(wú)顯著性差異，單純手術(shù)組成績(jī)較其余各組差，差異具有顯著性(p＜0.05)。 第二部分腦組織甲狀腺激素代謝變化 一.腦組織T3測(cè)定結(jié)果： 甲減組：5.81±0.40，術(shù)后給藥組：7.37±1.39，單純手術(shù)組：5.32±0.74，假手術(shù)組：9.92±1.9

13、9。方差分析顯示：?jiǎn)渭兪中g(shù)組較假手術(shù)組顯著下降(P＜0.01)，與甲減組無(wú)明顯差異；術(shù)后給藥組較單純手術(shù)組明顯增高(P＜0.01)，但與假手術(shù)組之間仍有顯著差異(P＜0.01)， 二.腦組織T4測(cè)定結(jié)果： 甲減組：17.35±3.00，術(shù)后給藥組：23.56±4.85，單純手術(shù)組：17.08±0.36，假手術(shù)組：26.34±3.20。方差分析顯示：?jiǎn)渭兪中g(shù)組與假手術(shù)組相比呈顯著性下降(P＜0.01)，但與甲減組比較無(wú)明顯

14、差異；術(shù)后給藥組較單純手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)，較假手術(shù)組稍低，兩者比較其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三.腦組織rT3測(cè)定結(jié)果： 甲減組：2.87±0.33，術(shù)后給藥組：2.20±0.23，單純手術(shù)組：2.65±0.19，假手術(shù)組：2.16±0.27。方差分析顯示：?jiǎn)渭兪中g(shù)組與假手術(shù)組相比明顯升高(P＜0.01)，較甲減組低，但兩者相比其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后給藥組較單純手術(shù)組下降(P＜0.01)，而與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、差異。 四.腦組織T4-5'-脫碘酶測(cè)定結(jié)果： 甲減組：3.83±1.43，術(shù)后給藥組：1.93±0.29，單純手術(shù)組：1.63±0.88，假手術(shù)組：3.11±0.88。方差分析顯示：術(shù)后給藥組、單純手術(shù)組均與假手術(shù)組有顯著性差異(P＜0.05)；術(shù)后給藥組脫碘酶活性較單純手術(shù)組有所增加，但無(wú)顯著性差異；甲減組與假手術(shù)組比較其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)論 一.慢性腦缺血導(dǎo)致大鼠對(duì)空間的學(xué)習(xí)記憶能力全面受損

16、。 二.慢性腦缺血時(shí)，大鼠T4-5'-脫碘酶活性明顯受損。 三.慢性腦缺血時(shí)，大鼠腦組織T3、T4、rT3濃度明顯變化并有其特點(diǎn)，隨著補(bǔ)充甲狀腺激素，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高，同時(shí)腦組織甲狀腺激素濃度有恢復(fù)正常趨勢(shì)，提示慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能損傷與其腦實(shí)質(zhì)損傷致甲狀腺激素水平異常有關(guān)。 四.慢性腦缺血大鼠與甲狀腺功能正常病態(tài)綜合征、甲狀腺功能減低引起的甲狀腺激素代謝變化不同。后兩者腦內(nèi)甲狀腺激素的變化為代償性，