重組AAV(rAAV)桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)的研究.pdf

1、腺相關(guān)病毒(Adeno-associated Viruses,AAV)感染人體后不會(huì)產(chǎn)生致病性,通過(guò)去除病毒基因僅保留兩端ITR序列進(jìn)一步增加了重組AAV載體的安全性,而且其攜帶的基因表達(dá)期比較長(zhǎng),因此在基因治療領(lǐng)域越來(lái)越受到人們的關(guān)注。然而,傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式很難滿足臨床上對(duì)AAV載體高產(chǎn)量的需求,這成為AAV載體在臨床應(yīng)用上的一個(gè)重大瓶頸,探索一種高效、安全和可放大的生產(chǎn)方式以得到高產(chǎn)量的AAV載體是滿足其臨床需求的必要條件。
　

2、　 除了腺病毒和單純皰疹病毒外,桿狀病毒也能為AAV的復(fù)制包裝提供輔助功能,而且桿狀病毒不會(huì)像腺病毒和單純皰疹病毒一樣對(duì)人體產(chǎn)生毒性,因此,利用桿狀病毒攜帶AAV包裝所需的順式和反式作用元件,借助桿狀病毒對(duì)昆蟲細(xì)胞Sf9的感染性,在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組AAV載體,是一種較為理想且能滿足臨床需求的新型重組AAV生產(chǎn)方式。
　　 重組AAV的桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)需要兩類反式因子:一是AAV的復(fù)制蛋白R(shí)ep78和Rep52,另外一類是AA

3、V的衣殼蛋白Cap1,Cap2和Cap3,可以由兩個(gè)桿狀病毒分別攜帶或者由單一的桿狀病毒攜帶。該系統(tǒng)所需的另外一個(gè)順式組分是攜帶AAV2的ITR及外源表達(dá)框(如EGFP)的重組桿狀病毒。
　　 根據(jù)AAV2的Rep和Cap基因序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增Rep78、Rep52、Cap1及Cap2+3。Rep78和Cap2+3一組,Rep52和Cap1一組分別構(gòu)建到pFastBacDual載體中。另外,我們借助一個(gè)能在昆蟲細(xì)胞中起作用

4、的內(nèi)含子將Rep和Cap基因構(gòu)建到一個(gè)同一載體中,借助內(nèi)含子的作用,Rep表達(dá)框能同時(shí)表達(dá)Rep78和Rep52,而Cap表達(dá)框能同時(shí)表達(dá)Cap1和Cap2+3。將這幾個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化DHl0BacTM感受態(tài)通過(guò)轉(zhuǎn)座重組得到重組Bacmid,轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞得到重組桿狀病毒Bac-AAV2Rep78Cap2+3、Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2RepiCapi。采用類似的方法得到重組桿狀病毒Bac-AAV2EGFP。其中,

5、Bac-AAV2Rep78Cap2+3,Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9細(xì)胞構(gòu)成三桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng),Bac-AAV2RepiCapi和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9細(xì)胞構(gòu)成兩桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng),兩套系統(tǒng)分別用來(lái)生產(chǎn)帶EGFP的重組AAV2載體rAAV2-EGFP。
　　 經(jīng)初步研究證明,三桿狀病毒系統(tǒng)和二桿狀病毒系統(tǒng)都能成功包裝出rAAV2-EGFP病毒。生產(chǎn)出的病毒經(jīng)AAV純化試劑盒

6、純化,通過(guò)定量PCR檢測(cè)病毒載體基因組產(chǎn)量,結(jié)果顯示:三桿狀病毒生產(chǎn)能力為每個(gè)Sf9細(xì)胞4.85x103VG(Virus vector genomes,病毒載體基因組),而二桿狀病毒達(dá)到了每個(gè)Sf9細(xì)胞6.12×104VG。進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè):前者生產(chǎn)能力為每個(gè)Sf9細(xì)胞3TU(Transduction Unit,轉(zhuǎn)導(dǎo)單位),后者則達(dá)到30TU左右,且感染HEK293細(xì)胞后都能看到較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá),說(shuō)明病毒活