禽多殺性巴氏桿菌基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建、免疫檢測及ptfa基因的原核表達(dá).pdf

1、禽多殺性巴氏桿菌病，又稱禽出血性敗血癥或者禽霍亂(fowl cholera)，是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)引起的一種接觸性、敗血性傳染病，可感染雞、鴨、鵝、鵪鶉和火雞等禽類。該病的發(fā)病率和死亡率均很高，具有突發(fā)性和流行的特點(diǎn)，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病具發(fā)病周期短死亡率高不易治療特點(diǎn)，被列為重點(diǎn)防治的家禽疫病之一，預(yù)防和控制本病的流行已刻不容緩。疫苗接種成為巴氏桿菌病的有效措施，多年來國內(nèi)

2、外學(xué)者一直都很重視對該病預(yù)防和控制的研究，研制高效的疫苗已成為研究熱點(diǎn)。近年來，所研究的禽多殺性巴氏桿菌抗原，主要有莢膜、菌毛、脂多糖和外膜蛋白，然而每種抗原所提供的保護(hù)力是有限的。高效的禽多殺性巴氏桿菌病疫苗應(yīng)該使疫苗中盡可能多的包含多種特征性重組抗原。本研究構(gòu)建出禽多殺性巴氏桿菌基因組表達(dá)文庫，以其免疫小鼠，篩選出具有免疫保護(hù)性抗原基因，為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)，并從所獲得的具有保護(hù)性抗原的基因文庫中提取單個(gè)片段的基因，對其進(jìn)行原核

3、表達(dá)分析，為進(jìn)一步開展深入的疫苗研制工作作了鋪墊。
　　本研究以禽多殺性巴氏桿菌CVCC474菌株作為研究對象，提取該菌的基因組，采用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ進(jìn)行酶切，將其酶切成500-3000bp的DNA片段，將其插入到真核表載體的BamHⅠ酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化人腸桿菌DH5a宿主，構(gòu)建出5個(gè)DNA表達(dá)子文庫，文庫總?cè)萘繛?05個(gè)克隆。分別提取5個(gè)文庫的重組質(zhì)粒，純化后將其溶解于PBS緩沖液，獲得重組質(zhì)粒；將105只6周齡純系雌性小白

4、鼠隨機(jī)分配為7組，每組15只。1-5組分別為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)空載體pcDNA3.1(+)組和PBS對照組。其中1-5組實(shí)驗(yàn)組分別免疫接種禽多殺性巴氏桿菌子文庫1-5所提取的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒用滅菌的1×PBS（pH7.2)稀釋，其濃度為100μg/μL，pcDNA3.1(+)組接種用用滅菌的1×PBS（pH7.2)稀釋，濃度為100μg/μL的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)；PBS組接種1×PBS（pH7.2)。每只小鼠每次免疫劑量為100

5、μL，采取雙側(cè)脛前肌注射，自第一次免疫開始每隔2周免疫一次，共免疫3次。然后通過對各免疫組小鼠的血清特異性抗體、細(xì)胞免疫應(yīng)答和相對保護(hù)率的檢測，來篩選確定免疫效果較好的組，篩選含有保護(hù)性抗原基因的子文庫，結(jié)果篩選出基因組表達(dá)子文庫1為免疫效果較好的文庫，證明文庫中含有保護(hù)性基因，為進(jìn)一步篩選保護(hù)性抗原基因打下基礎(chǔ)，有助于從分子水平上認(rèn)識禽多殺性巴氏桿菌和尋找禽霍亂病的新的基因。同時(shí)研制出預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病的廉價(jià)、高效疫苗打下基礎(chǔ)。然