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文檔簡介
1、目的:
嬰幼兒的臨床醫(yī)療中常需要使用全身麻醉藥物,其安全性及對(duì)腦的發(fā)育和長期認(rèn)知功能是否有不良影響,一直是專家學(xué)者以及患兒父母關(guān)注的問題。目前全麻藥如何導(dǎo)致認(rèn)知功能的損害或缺失目前仍未闡明清楚,并且缺乏其有效的臨床干預(yù)手段。研究全麻藥發(fā)育期神經(jīng)毒性的發(fā)生機(jī)制,探尋有效的干預(yù)途徑是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一,并具有重要的理論與實(shí)踐意義。本課題擬利用異氟醚引起的發(fā)育期神經(jīng)毒性模型,觀察組胺H3受體激動(dòng)劑RAMH對(duì)全麻藥異氟醚發(fā)育期神
2、經(jīng)毒性的作用。以期明確:(1)RAMH預(yù)處理對(duì)異氟醚引起的新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響。(2)RAMH預(yù)處理對(duì)異氟醚引起的幼年大鼠記憶損害的影響。(3)異氟醚暴露后發(fā)育期大鼠海馬p53表達(dá)及RAMH的影響。
方法:
1.RAMH預(yù)處理對(duì)異氟醚引起的新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響
用出生第6天新生SD大鼠,隨機(jī)均分為3組。對(duì)照組4只,給予腹腔注射5%葡萄糖;模型組5只,正常造模,吸入1.6%的異氟醚持續(xù)6小
3、時(shí),復(fù)蘇2小時(shí);RAMH預(yù)處理組5只,先腹腔注射RAMH(0.1mg/10g)后30分鐘,然后造模,吸入1.6%的異氟醚6小時(shí)。造模時(shí),吸入氧濃度為21%,輸出氣體總流量為1.5L/分鐘,異氟醚濃度1.6%。每小時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)新生大鼠呼吸及皮膚色澤情況,等6小時(shí)異氟醚吸入麻醉完畢后,關(guān)閉異氟醚,繼續(xù)吸入21%氧氣,給予蘇醒期2小時(shí),待新生大鼠自然蘇醒。造模完成后,灌注取腦,將腦組織放入4攝氏度多聚甲醛溶液浸泡,后固定24小時(shí)。然后按15%到
4、30%的蔗糖濃度的梯度脫水,直至大腦組織沉底。接著以冠狀位,包埋腦組織。放入-80攝氏度快速冷卻。以冠狀位行冰凍切片,切片厚度20um。而后進(jìn)行免疫熒光染色,觀察Caspase-3在各腦區(qū)的表達(dá)情況。
2.RAMH預(yù)處理對(duì)異氟醚引起的幼年大鼠記憶損害的影響。
用出生第6天新生SD大鼠,隨機(jī)均分為4組。CON組7只,給予腹腔注射5%葡萄糖;ISO組7只,正常造模,吸入1.6%的異氟醚持續(xù)7小時(shí),然后復(fù)蘇2小時(shí);RAMH
5、組7只,腹腔注射RAMH(10mg/kg)后,放回鼠籠;RAMH+ISO組7只,先腹腔注射RAMH(10mg/kg)后30分鐘,造模,吸入1.6%的異氟醚6小時(shí)。造模完成后,將新生SD大鼠統(tǒng)一放回鼠籠,直至第5周,進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。用分析軟件分析大鼠的游泳路線、尋找平臺(tái)潛伏期和新生大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間以及其距目標(biāo)平臺(tái)的平均距離,從而測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。
3.異氟醚暴露后發(fā)育期大鼠海馬p53表達(dá)及RAMH的
6、影響。
用出生第6天新生SD大鼠,隨機(jī)均分為3組。對(duì)照組5只,給予腹腔注射5%葡萄糖;模型組5只,正常造模,吸入1.6%的異氟醚持續(xù)6小時(shí),復(fù)蘇2小時(shí);RAMH預(yù)處理組5只,先腹腔注射RAMH(10mg/kg)后30分鐘,然后造模,吸入1.6%的異氟醚6小時(shí)。造模時(shí),吸入氧濃度為21%,輸出氣體總流量為1.5L/分鐘,異氟醚濃度1.6%。每小時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)新生大鼠呼吸及皮膚色澤情況,等6小時(shí)異氟醚吸入麻醉完畢后,關(guān)閉異氟醚,繼續(xù)吸
7、入21%氧氣,給予蘇醒期2小時(shí),待新生大鼠自然蘇醒。造模完成后,迅速將新生大鼠斷頭,取出大腦,分離出雙側(cè)海馬,用液氮快速冷凍后,置于-80攝氏度冰箱保存。然后提取目的蛋白,用BCA法測(cè)定樣品的蛋白濃度,并使蛋白變性。然后制作Page凝膠,組裝電泳槽進(jìn)行蛋白電泳,使樣品目的蛋白分開。然后通過轉(zhuǎn)膜的方法把蛋白從Page凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后封閉,孵育一抗,二抗,最后顯影。觀察在RAMH預(yù)處理后異氟醚暴露下發(fā)育期大鼠海馬p53的表達(dá)情況
8、。
結(jié)果:
1.新生第6天的SD大鼠,在異氟醚暴露6小時(shí)后,海馬各區(qū)(包括CA1、CA3、DG區(qū))Caspase-3信號(hào)表達(dá)顯著增強(qiáng),神經(jīng)元凋亡明顯,而給予組胺H3受體激動(dòng)劑RAMH的新生大鼠相較于模型組海馬各區(qū)Caspase3信號(hào)表達(dá)減少,神經(jīng)元凋亡得以改善。
2.新生第6天的SD大鼠,在異氟醚暴露6小時(shí)后,飼養(yǎng)至出生第5周,ISO組幼年大鼠在第1、2、3、4天尋找平臺(tái)潛伏期明顯延長,且在目標(biāo)象限停留時(shí)間
9、明顯減少,而距目標(biāo)平臺(tái)的平均距離明顯增加。而RAMH+ISO組與ISO組相比,在第1、2天尋找平臺(tái)潛伏期沒有明顯改變,而第3、4、5天尋找平臺(tái)潛伏期明顯減少,且在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯增長,而距目標(biāo)平臺(tái)的平均距離明顯縮短。
3.新生第6天的SD大鼠,在異氟醚暴露6小時(shí)后,ISO組新生大鼠海馬區(qū)p53蛋白表達(dá)明顯增多。而RAMH+ISO組與ISO組相比,發(fā)育期大鼠海馬區(qū)p53蛋白表達(dá)明顯減少。
結(jié)論:
RAMH
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