異氟烷誘導的發(fā)育期大鼠大腦神經毒性及米諾環(huán)素的保護作用.pdf

1、背景：異氟烷是目前臨床麻醉中常用的吸入麻醉藥之一，自1982年問世以來已經在臨床使用了將近20年時間。異氟烷適用于包括嬰幼兒在內的各年齡段的手術患者，應用范圍廣泛。但是，自1999年首先發(fā)現NMDA 受體阻斷劑能引起發(fā)育期大鼠發(fā)生神經元廣泛凋亡以來，有關異氟烷是否具有發(fā)育期神經毒性的問題迅速引起麻醉工作者、神經學家和患者的廣泛關注。
　　 目前已有研究發(fā)現，發(fā)育期臨床相關濃度和時間的異氟烷麻醉能誘導大鼠中樞神經系統(tǒng)包括大腦皮層、

2、海馬、丘腦以及脊髓等部位的神經元凋亡增加；能影響發(fā)育期神經元的神經突的生長速度和突起的數量；并且發(fā)育期的異氟烷麻醉能引起一定時間后大鼠的行為學改變。然而，目前研究中仍有許多爭議的地方，特別是異氟烷引起神經毒性的機制和發(fā)育期異氟烷麻醉后是否能遺留長期的結構和行為學改變及機制等方面。此外，目前尚缺乏能針對異氟烷誘導的發(fā)育期神經毒性機制的，能有效預防或消除此種毒性作用的藥物。
　　 本研究擬首先通過觀察異氟烷麻醉對發(fā)育期大鼠皮層和海馬

3、神經元凋亡、遠期神經元密度和學習記憶能力、皮層和海馬前炎癥因子mRNA表達和相關信號通路的影響，明確臨床相關濃度異氟烷對發(fā)育期（出生后7天，P7）大鼠的神經毒性作用及可能機制，并為下一步的干預研究提供可靠的基礎。進而通過離體和在體研究觀察米諾環(huán)素對異氟烷誘導的發(fā)育期神經毒性的保護作用，為有效減輕或消除異氟烷的發(fā)育期神經毒性提供藥物選擇。這些研究預期將為臨床上更加科學、更加安全使用異氟烷提供理論依據。
　　 目的：
　　

4、1、明確異氟烷對發(fā)育期大鼠皮層和海馬神經元凋亡和遠期神經元密度的影響；
　　 2、研究異氟烷對發(fā)育期大鼠大腦前炎癥因子mRNA表達的影響，探討可能機制；
　　 3、明確發(fā)育期異氟烷麻醉對大鼠遠期學習記憶能力的影響；
　　 4、觀察米諾環(huán)素對異氟烷誘導的大鼠發(fā)育期神經毒性的保護作用。
　　 方法：
　　 1、凋亡神經元統(tǒng)計和神經元密度計算P7 Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，隨機分為

5、對照組（C組）和異氟烷麻醉組（A組）。A組大鼠35℃恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h。每組取3只大鼠，行動脈血氣分析。每組各另取3只大鼠用免疫組織化學法檢測大腦皮層和海馬activecaspase-3陽性神經元，計算陽性率。其余大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至出生后60 d后用免疫組織化學法檢測大腦NeuN表達，比較兩組大鼠皮層神經元密度。
　　 2、觀察前炎癥因子mRNA動態(tài)表達和IκBα蛋白變化P7 SD大鼠64只，隨機

6、分為對照組（C組）和異氟烷麻醉組（A組）。A組大鼠35℃
　　 恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h。A組于麻醉前（T0，基礎狀態(tài)）、麻醉2 h（T1）、4 h（T2）、6 h（T3）、麻醉停止后4 h（T4）、6 h（T5）、12 h（T6）、24 h（T7）時，C組在對應時點各取4只大鼠，提取總RNA，實時定量PCR（Real-time PCR）
　　 測定海馬和皮層IL-1βmRNA、IL-6 m

7、RNA及TNF-αmRNA的表達水平。提取總蛋白，Western blot測定IκBα蛋白含量。
　　 3、水迷宮實驗檢測大鼠遠期學習記憶能力P7 SD大鼠20只，隨機分為對照組（C組）和異氟烷麻醉組（A組）。A組大鼠35℃
　　 恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h。待大鼠麻醉蘇醒后，回籠繼續(xù)飼養(yǎng)至出生后60 d，行Morris Water Maze水迷宮實驗。觀察大鼠在平臺隱藏實驗和平臺轉移實驗中的

8、差別。
　　 4、米諾環(huán)素對原代培養(yǎng)神經元的保護作用取新生SD大鼠皮層，神經元原代培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)5d后，隨機分為對照組（C組）、異氟烷麻醉組（A組）、米諾環(huán)素1 μmol/L組（M1組）及米諾環(huán)素10 μmol/L組（M2組）。C組神經元在37℃下空氣處理6 h，A組神經元在37℃下用1.5％異氟烷處理6 h，M1和M2組神經元分別在加入米諾環(huán)素1 μmol/L、10 μmol/L 10min后同A組一起進行異氟烷處理。

9、相差顯微鏡下觀察4組神經元形態(tài)，MTT檢測神經元活性，TUNEL法檢測神經元凋亡。
　　 5、米諾環(huán)素對發(fā)育期大鼠的保護作用P7 SD大鼠45只，隨機分為對照組（C組）、異氟烷麻醉組（A組）、米諾環(huán)素組（M組）。A組大鼠分別在35℃恒溫下1.5％異氟烷麻醉6 h，C組自主吸入空氣6 h，M組大鼠分別在麻醉前腹腔注射米諾環(huán)素45mg/kg后同A組一起麻醉。A組、M組于麻醉前（T0，基礎狀態(tài)）、麻醉2 h（T1）、4 h（T2）、6

10、 h（T3）、C組在對應時點各取3只大鼠，提取總RNA，Real-time PCR測定海馬IL-1βmRNA、IL-6 mRNA及TNF-αmRNA的表達水平；提取T2 時間點總蛋白，Western blot測定IκBα蛋白含量。每組在T3各另取3只大鼠檢測大腦皮層active caspase-3陽性神經元并計算陽性率。
　　 結果：
　　 1、凋亡神經元數量和神經元密度A組大鼠皮層active caspase-3 陽性

11、神經元數量明顯多于C組（P<0.05）。兩組大鼠海馬陽性神經元數量差別無統(tǒng)計學意義。兩組大鼠遠期皮層神經元密度相當。
　　 2、前炎癥因子mRNA 動態(tài)表達和IκBα蛋白變化C組各時點海馬IL-1βmRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA 比較差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；與C組比較，A組海馬T1~5時IL-1βmRNA表達上調，T2、T3 時IL-6mRNA表達上調，T1~6 時TNF-αmRNA表達上調（P<0.

12、05）。A組IκBα蛋白在各個時點的表達均較C組下降（P<0.05）。
　　 3、大鼠遠期學習記憶能力在4天的訓練過程中，兩組大鼠的尋臺潛伏期都進行性縮短，但是兩組大鼠在尋臺潛伏期、目標象限停留時間和穿越平臺次數等指標上的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 4、米諾環(huán)素對原代培養(yǎng)神經元的保護作用A組神經元出現胞體腫脹、變形等改變；M1組神經元形態(tài)與A組接近，M2組神經元形態(tài)改變不明顯，與C組相近。MTT 結果顯示A組、M1組神經元

13、活性低于C組、M2組（P<0.05）。A組、M1組凋亡神經元數目明顯多于C組、M2組（P<0.05）。
　　 5、米諾環(huán)素對發(fā)育期大鼠的保護作用M組皮層神經元凋亡明顯少于A組（P<0.05）。T1~3 IL-1βmRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表達均低于A組（P<0.05）。M組IκBα蛋白表達水平高于A組（P<0.05）。
　　 結論：
　　 1、1.5％異氟烷麻醉6 h 能誘導發(fā)育期SD 大鼠