人皮膚毛囊干細(xì)胞體外無(wú)血清擴(kuò)增的相關(guān)研究.pdf

1、背景:
　　皮膚上皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于人造皮膚的制造和傷口修復(fù)已有多年歷史，但通常所用的干細(xì)胞為單一分化潛能的表皮干細(xì)胞，無(wú)法重建任何皮膚附屬器官，實(shí)現(xiàn)皮膚的全部功能。研究表明毛囊干細(xì)胞具有修復(fù)表皮，分化為毛發(fā)、皮脂腺、汗腺的多分化潛能，是傷口修復(fù)和人造皮膚的理想種子細(xì)胞。然而人類正常皮膚組織中，毛囊干細(xì)胞的比例極低，一根毛囊僅能提取200-400個(gè)毛囊干細(xì)胞，而臨床治療所需的毛囊干細(xì)胞通常需要百萬(wàn)數(shù)量級(jí)以上，原代毛囊干細(xì)胞數(shù)

2、量遠(yuǎn)不能滿足需求。而毛囊干細(xì)胞傳統(tǒng)體外培養(yǎng)需要滋養(yǎng)層細(xì)胞及血清培養(yǎng)，但這樣的細(xì)胞產(chǎn)品不能用于臨床治療，因此急需建立支持人類毛囊干細(xì)胞體外無(wú)血清無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞的擴(kuò)增技術(shù)。
　　運(yùn)用小分子抑制劑可以精確對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行激活或抑制，在細(xì)胞培養(yǎng)研究領(lǐng)域已經(jīng)取得一些進(jìn)展。小分子抑制劑Y-27632為Rock的抑制劑，可以促使人胚胎干細(xì)胞、角質(zhì)上皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞的凋亡;A83-01可以抑制TGF-βⅠ型受體ALK5的轉(zhuǎn)錄活性，協(xié)同CHIR-9

3、9021可將成熟肝細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成干細(xì)胞，A83-01協(xié)同DMH-1、CHIR-99021、Y-27632在無(wú)血清無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞的條件下能夠在體外大量擴(kuò)增某些上皮細(xì)胞。以上這些結(jié)果表明在細(xì)胞培養(yǎng)中利用小分子抑制劑可以一定程度上彌補(bǔ)無(wú)血清培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)性狀改變，開拓干細(xì)胞培養(yǎng)的新局面。目前，A83-01、DMH-1、CHIR-99021、Y-27632在毛囊干細(xì)胞體外無(wú)血清擴(kuò)增的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本課題擬建立符合本實(shí)驗(yàn)室及貼近臨床

4、運(yùn)用的人毛囊干細(xì)胞采集純化保存的規(guī)范化流程，在此基礎(chǔ)上研究小分子抑制劑A83-01、DMH-1、CHIR-99021、Y-27632對(duì)人毛囊干細(xì)胞體外無(wú)血清擴(kuò)增的影響，為人毛囊干細(xì)胞臨床應(yīng)用及研究提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
　　目的:
　　1.建立人毛囊干細(xì)胞庫(kù)及細(xì)胞采集純化保存的規(guī)范化流程，并行鑒定;
　　2.探索體外無(wú)血清培養(yǎng)人毛囊干細(xì)胞方法，優(yōu)化擴(kuò)增人毛囊干細(xì)胞及維持干性的條件。
　　方法:
　　

5、1.人毛囊外根鞘細(xì)胞獲取:采用DispaseⅡ初步消化帶毛囊組織，顯微鏡下拔取毛囊，剔除皮脂腺，離斷毛乳頭，0.05％Trypsin-EDTA消化獲得人毛囊外根鞘細(xì)胞單細(xì)胞懸液。免疫熒光染色觀察處理前后干細(xì)胞變化。
　　2.差速貼壁富集毛囊干細(xì)胞及原代細(xì)胞培養(yǎng):利用含人Ⅰ型膠原的COATINGMATRIX KIT進(jìn)行包被培養(yǎng)皿，15min差速貼壁分離毛囊干細(xì)胞，利用CNT-PR原代上皮培養(yǎng)液添加Y-27632進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。流式

6、分析及免疫熒光觀察純化結(jié)果。
　　3.人毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)條件探索:分組培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞，對(duì)照組培養(yǎng)基(CNT組)、實(shí)驗(yàn)組1（A83-01組）、實(shí)驗(yàn)組2（DMH-1組）、實(shí)驗(yàn)組3（A83-01+DMH-1組）、實(shí)驗(yàn)組4(CHIR-99021)、實(shí)驗(yàn)組5（A83-01+DMH-1+ CHIR-99021組），CCK-8行細(xì)胞分組條件下短期培養(yǎng)細(xì)胞增殖速度，傳代培養(yǎng)時(shí)，每代記錄接種細(xì)胞及收細(xì)胞數(shù)目，免疫熒光染色K15細(xì)胞比例，計(jì)算細(xì)胞擴(kuò)增

7、總量及K15陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)增情況。
　　結(jié)果:
　　1、免疫熒光染色定位毛囊干細(xì)胞于毛囊的中段，顯微外科除去毛乳頭及皮脂腺，初步提高了毛囊干細(xì)胞純化效果;
　　2、以含人Ⅰ型膠原的COATING MATRIX KIT進(jìn)行差速貼壁分離毛囊于細(xì)胞，有效富集CD200+/CD49+毛囊干細(xì)胞(P＜0.05)，同時(shí)避免傳統(tǒng)利用小鼠Ⅳ型膠原差速貼壁帶來(lái)的異種蛋白侵入危險(xiǎn);
　　3、成功在無(wú)血清、無(wú)滋養(yǎng)層、培養(yǎng)基成分限定的條件下

8、進(jìn)行原代干細(xì)胞體外培養(yǎng)16±3天，每根毛囊可取得4.5±0.7×104 K15陽(yáng)性細(xì)胞;
　　4、添加A83-01、Y-27632或者添加A83-01、DMH-1、Y-27632于CNT-PR培養(yǎng)基較單純添加Y-27632于CNT-PR培養(yǎng)基或其他分組，能提高總體細(xì)胞及K15陽(yáng)性細(xì)胞增殖速度，縮短擴(kuò)增時(shí)間(P＜0.05);
　　5、本實(shí)驗(yàn)流程可在無(wú)血清、無(wú)滋養(yǎng)層、培養(yǎng)基成分限定的條件下進(jìn)行毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增，利于實(shí)驗(yàn)研究的