人皮膚毛囊干細胞體外無血清擴增的相關(guān)研究.pdf

1、背景:
　　皮膚上皮干細胞作為種子細胞用于人造皮膚的制造和傷口修復(fù)已有多年歷史，但通常所用的干細胞為單一分化潛能的表皮干細胞，無法重建任何皮膚附屬器官，實現(xiàn)皮膚的全部功能。研究表明毛囊干細胞具有修復(fù)表皮，分化為毛發(fā)、皮脂腺、汗腺的多分化潛能，是傷口修復(fù)和人造皮膚的理想種子細胞。然而人類正常皮膚組織中，毛囊干細胞的比例極低，一根毛囊僅能提取200-400個毛囊干細胞，而臨床治療所需的毛囊干細胞通常需要百萬數(shù)量級以上，原代毛囊干細胞數(shù)

2、量遠不能滿足需求。而毛囊干細胞傳統(tǒng)體外培養(yǎng)需要滋養(yǎng)層細胞及血清培養(yǎng)，但這樣的細胞產(chǎn)品不能用于臨床治療，因此急需建立支持人類毛囊干細胞體外無血清無滋養(yǎng)層細胞的擴增技術(shù)。
　　運用小分子抑制劑可以精確對信號通路進行激活或抑制，在細胞培養(yǎng)研究領(lǐng)域已經(jīng)取得一些進展。小分子抑制劑Y-27632為Rock的抑制劑，可以促使人胚胎干細胞、角質(zhì)上皮細胞增殖，抑制細胞的凋亡;A83-01可以抑制TGF-βⅠ型受體ALK5的轉(zhuǎn)錄活性，協(xié)同CHIR-9

3、9021可將成熟肝細胞逆轉(zhuǎn)成干細胞，A83-01協(xié)同DMH-1、CHIR-99021、Y-27632在無血清無滋養(yǎng)層細胞的條件下能夠在體外大量擴增某些上皮細胞。以上這些結(jié)果表明在細胞培養(yǎng)中利用小分子抑制劑可以一定程度上彌補無血清培養(yǎng)營養(yǎng)不足導(dǎo)致的細胞生物學(xué)性狀改變，開拓干細胞培養(yǎng)的新局面。目前，A83-01、DMH-1、CHIR-99021、Y-27632在毛囊干細胞體外無血清擴增的作用尚未見相關(guān)報道。本課題擬建立符合本實驗室及貼近臨床

4、運用的人毛囊干細胞采集純化保存的規(guī)范化流程，在此基礎(chǔ)上研究小分子抑制劑A83-01、DMH-1、CHIR-99021、Y-27632對人毛囊干細胞體外無血清擴增的影響，為人毛囊干細胞臨床應(yīng)用及研究提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
　　目的:
　　1.建立人毛囊干細胞庫及細胞采集純化保存的規(guī)范化流程，并行鑒定;
　　2.探索體外無血清培養(yǎng)人毛囊干細胞方法，優(yōu)化擴增人毛囊干細胞及維持干性的條件。
　　方法:
　　

5、1.人毛囊外根鞘細胞獲取:采用DispaseⅡ初步消化帶毛囊組織，顯微鏡下拔取毛囊，剔除皮脂腺，離斷毛乳頭，0.05％Trypsin-EDTA消化獲得人毛囊外根鞘細胞單細胞懸液。免疫熒光染色觀察處理前后干細胞變化。
　　2.差速貼壁富集毛囊干細胞及原代細胞培養(yǎng):利用含人Ⅰ型膠原的COATINGMATRIX KIT進行包被培養(yǎng)皿，15min差速貼壁分離毛囊干細胞，利用CNT-PR原代上皮培養(yǎng)液添加Y-27632進行原代細胞培養(yǎng)。流式

6、分析及免疫熒光觀察純化結(jié)果。
　　3.人毛囊干細胞的培養(yǎng)條件探索:分組培養(yǎng)毛囊干細胞，對照組培養(yǎng)基(CNT組)、實驗組1（A83-01組）、實驗組2（DMH-1組）、實驗組3（A83-01+DMH-1組）、實驗組4(CHIR-99021)、實驗組5（A83-01+DMH-1+ CHIR-99021組），CCK-8行細胞分組條件下短期培養(yǎng)細胞增殖速度，傳代培養(yǎng)時，每代記錄接種細胞及收細胞數(shù)目，免疫熒光染色K15細胞比例，計算細胞擴增

7、總量及K15陽性細胞擴增情況。
　　結(jié)果:
　　1、免疫熒光染色定位毛囊干細胞于毛囊的中段，顯微外科除去毛乳頭及皮脂腺，初步提高了毛囊干細胞純化效果;
　　2、以含人Ⅰ型膠原的COATING MATRIX KIT進行差速貼壁分離毛囊于細胞，有效富集CD200+/CD49+毛囊干細胞(P＜0.05)，同時避免傳統(tǒng)利用小鼠Ⅳ型膠原差速貼壁帶來的異種蛋白侵入危險;
　　3、成功在無血清、無滋養(yǎng)層、培養(yǎng)基成分限定的條件下

8、進行原代干細胞體外培養(yǎng)16±3天，每根毛囊可取得4.5±0.7×104 K15陽性細胞;
　　4、添加A83-01、Y-27632或者添加A83-01、DMH-1、Y-27632于CNT-PR培養(yǎng)基較單純添加Y-27632于CNT-PR培養(yǎng)基或其他分組，能提高總體細胞及K15陽性細胞增殖速度，縮短擴增時間(P＜0.05);
　　5、本實驗流程可在無血清、無滋養(yǎng)層、培養(yǎng)基成分限定的條件下進行毛囊干細胞的培養(yǎng)擴增，利于實驗研究的