針對白蛋白及CD19的新型核酸適配體的篩選.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 針對白蛋白的新型核酸適配體的篩選和鑒定
　　目的:蛋白質(zhì)組學(xué)是研究和發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志物的重要技術(shù)手段。然而，由于許多重要的生物標(biāo)志物都是低豐度蛋白，分析時會受到樣品其他高豐度蛋白的影響，降低蛋白質(zhì)組學(xué)方法的靈敏度，使檢測面臨困難。白蛋白在體內(nèi)可占到血漿蛋白總量的80％以上，同時也廣泛存在于其他體液中，比如腦脊液、尿液、唾液和淚液等。因此在進(jìn)行體液蛋白質(zhì)組的分析過程中，有時在分析

2、前要將白蛋白去除，以提高蛋白鑒定的深度，鑒定出更多的蛋白生物標(biāo)志物。目前，去除白蛋白的手段主要基于抗體技術(shù)。但抗體價格較高且有時存在穩(wěn)定性問題，一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用，因此有必要探索去除白蛋白的新技術(shù)。除抗體外，核酸適配體(Aptamer)也可識別蛋白。核酸適配體是短的單鏈DNA或RNA分子，可以折疊成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，以較高的親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)分子。與抗體相比，核酸適配體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，容易修飾，合成成本低，因此有望成為良好的抗體替代

3、物。目前，針對白蛋白的核酸適配體尚未見報道。本研究旨在篩選針對白蛋白的核酸適配體，為研發(fā)去除白蛋白的新技術(shù)提供基礎(chǔ)。
　　方法:以白蛋白作為靶標(biāo)，通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選一種能夠以較好的親和性和特異性結(jié)合白蛋白的核酸適配體;利用流式細(xì)胞術(shù)對篩選進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測，并檢測篩選到的核酸適配體與靶標(biāo)白蛋白以及對照蛋白(免疫球蛋白IgG、胰蛋白酶trypsin、卵清蛋白o(hù)valbumin)的結(jié)合情況，對其結(jié)合靶標(biāo)的能力進(jìn)

4、行評估。
　　結(jié)果:(1)篩選到一種能與白蛋白結(jié)合的DNA核酸適配體A6，長度為59個堿基。其一級序列為5'-TGCGTGTGTAGTGTGTCTGCGCTGTTCTATGCCTTCGGCGCTCTTAGGGATTTGGGCGG-3，(2)該核酸適配體與白蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)，親和系數(shù)為77.4nmol/L。(3)該核酸適配體的特異性較好，與免疫球蛋白(IgG)、胰蛋白酶(Trypsin)、卵清蛋白(Ovalbumin)的交叉結(jié)合相對

5、較弱。
　　結(jié)論:本研究篩選出了一種針對白蛋白的核酸適配體A6，該核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合的親和力良好，且與其他蛋白的結(jié)合相對較低。相對于抗體，A6作為一種核酸適配體具有合成簡便、價格低廉等優(yōu)點，有望在去除白蛋白的新方法中發(fā)揮作用。
　　第二部分 新型CD19核酸適配體的篩選
　　目的:淋巴瘤(Lymphoma)是一種發(fā)病率逐年上升的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，淋巴瘤的靶向治療越來越受到關(guān)注，因為相比于傳統(tǒng)的放療與化療，靶向

6、治療在發(fā)揮藥物療效的同時還可減輕藥物對正常組織和細(xì)胞的損傷。CD19是高表達(dá)于B細(xì)胞淋巴瘤的分子，是治療淋巴瘤的重要靶點。淋巴瘤分為兩大類，包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)，而大多數(shù)的NHL為B細(xì)胞來源的腫瘤，高表達(dá)CD19。靶向治療需要靶向分子，核酸適配體(Aptamer)是一種具有較大應(yīng)用潛能的新型靶向分子。核酸適配體在結(jié)構(gòu)上是由短

7、鏈DNA或RNA分子構(gòu)成，它可以通過自身的折疊形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等，以較高的親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)。相比于抗體，核酸適配體一個較大的優(yōu)勢是價格相對低廉，可化學(xué)合成，并在體外進(jìn)行大量生產(chǎn)。除此之外，核酸適配體還具有免疫原性低、易于修飾、能夠耐受高溫以及酸堿環(huán)境、不同生產(chǎn)批次間質(zhì)量較為穩(wěn)定等優(yōu)勢，這使其有望成為一種相對理想的靶向分子。目前，文獻(xiàn)中尚未見關(guān)于CD19的核酸適配體的研究工作。本課題篩選了第一個能夠結(jié)合CD19的

8、DNA核酸適配體，在體外評估了其與CD19陽性淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合特性，并且構(gòu)建了核酸適配體-阿霉素(Apt-dox)復(fù)合體，評估了該復(fù)合體對CD19陽性淋巴瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用。
　　方法:以CD19蛋白作為靶標(biāo)，用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選能與CD19蛋白結(jié)合的核酸適配體。用流式細(xì)胞儀分別檢測適配體與CD19蛋白，白蛋白、卵清蛋白的結(jié)合，及與CD19陽性淋巴瘤細(xì)胞（Ramos細(xì)胞和Raji細(xì)胞）和CD19陰性細(xì)胞

9、（Jurkat細(xì)胞和NB-4細(xì)胞）的結(jié)合。利用共聚焦顯微鏡對核酸適配體與這四種細(xì)胞結(jié)合的情況進(jìn)行觀察。將阿霉素嵌入適配體結(jié)構(gòu)中構(gòu)建Apt-dox復(fù)合體，并利用阿霉素?zé)晒夤庾V評估復(fù)合體構(gòu)建情況。利用共聚焦顯微鏡評估CD19陽性細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞對Apt-dox復(fù)合體的攝取。應(yīng)用MTS法檢測Apt-dox復(fù)合體對CD19陽性細(xì)胞以及陰性細(xì)胞的殺傷作用。
　　結(jié)果:(1)所篩選到的針對CD19的核酸適配體L7，長度為59個堿基，經(jīng)測序分

10、析，其一級序列為5'-TGCGTGTGTAGTGTGTCTGTTCTCCTTTTTTTGGTTGCTGCTCTTAGGGATTTGGGCGG-3'(2)核酸適配體L7可與CD19蛋白以較高的親和力結(jié)合，親和力數(shù)為85.4 nmol/L，且與白蛋白、卵清蛋白等交叉結(jié)合較弱。(3)核酸適配體L7能夠識別CD19陽性的淋巴瘤細(xì)胞Ramos和Raji，但基本不與CD19陰性的細(xì)胞Jurkat和NB4細(xì)胞結(jié)合。(4)該Apt-dox復(fù)合體能夠攜帶

11、阿霉素進(jìn)入CD19陽性淋巴瘤細(xì)胞，并降低藥物在CD19陰性細(xì)胞中的攝取。(5)Apt-dox復(fù)合體可保持阿霉素對CD19陽性淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用，但顯著降低了CD19陰性細(xì)胞的殺傷。
　　結(jié)論:本研究篩選到了首個針對CD19的DNA核酸適配體L7。該適配體能夠以較高的親和力和特異性結(jié)合CD19蛋白，識別CD19陽性的淋巴瘤細(xì)胞，且與其他蛋白和陰性細(xì)胞的交叉結(jié)合較弱。該核酸適配體與阿霉素構(gòu)建的復(fù)合體(Apt-dox)可以選擇性地將阿