細(xì)絲蛋白A影響EGFR突變陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼治療的敏感性.pdf

1、目的：肺癌長(zhǎng)期以來(lái)是全球癌癥相關(guān)死亡的首要原因。肺癌中最常見(jiàn)的亞型是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），約占80％?？傮w來(lái)說(shuō)，NSCLC治療效果不盡如人意。盡管化療取得了很大進(jìn)步，但即使最有效的以鉑類為基礎(chǔ)的新一代的化療方案也只使中位總生存期（OS）延長(zhǎng)至最多10個(gè)月。通過(guò)對(duì)NSCLC發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)分子事件的深入研究，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），一類酪氨酸激酶受體，成為NSCLC治療方案中一個(gè)重要靶標(biāo)。它們可與EGFR或其它HER家族成員結(jié)

2、合形成二聚體，在關(guān)鍵的酪氨酸殘基上發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)一步激活一系列下游信號(hào)通路如PI3K/AKT/mTOR，RAS/RAF/MAPK，JAK/STAT，這對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)程序包括增殖，存活和凋亡起重要作用。EGFR信號(hào)通路的激活由基因突變或（和）基因擴(kuò)增引起，已證實(shí)它們與NSCLC的發(fā)生，進(jìn)展和不良預(yù)后關(guān)系密切。EGFR激活突變主要位于酪氨酸激酶區(qū)域，以19外顯子堿基對(duì)缺失或21外顯子點(diǎn)突變的形式發(fā)生，這可見(jiàn)于約20%的NSCLC患者。

3、這些突變使EGFR激活，進(jìn)而激活其下游的信號(hào)分子。第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs），吉非替尼和厄洛替尼，可逆的競(jìng)爭(zhēng)ATP結(jié)合位點(diǎn)從而阻斷EGFR誘導(dǎo)的下游信號(hào)通路的激活，在NSCLC的治療中廣泛應(yīng)用。大量研究表明EGFR突變陽(yáng)性的NSCLC患者應(yīng)用吉非替尼或厄洛替尼對(duì)比卡鉑/紫杉醇可顯著延長(zhǎng)中位無(wú)病進(jìn)展生存期（PFS），明顯改善生活質(zhì)量，延緩癥狀惡化。然而，仍有約30%EGFR突變陽(yáng)性的患者對(duì)EGFR-TKIs不敏感

4、。因此，探討影響腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI敏感性的分子機(jī)制，對(duì)臨床合理選擇治療NSCLC藥物及判斷藥物療效具有重要意義。細(xì)絲蛋白A（FLNa)，同時(shí)也稱肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白280(ABP280)，最初被認(rèn)為是一種非肌動(dòng)蛋白細(xì)絲交聯(lián)蛋白。隨后報(bào)導(dǎo)說(shuō)明了此蛋白在細(xì)胞收縮和伸展中具有重要作用。FLNa作為重要腳手架分子，促進(jìn)蛋白-蛋白之間的相互作用并影響蛋白細(xì)胞定位。研究證實(shí)FLNa凝結(jié)蛋白參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在多種類型癌組織過(guò)表達(dá)，由于其與腫瘤發(fā)

5、生相關(guān)， FLNa在腫瘤細(xì)胞中的作用已成為研究熱點(diǎn)。Zhu等已經(jīng)證實(shí)降低FLNa的表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌PC-9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。FLNa可抑制PC-9細(xì)胞EGFR及其下游MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激酶的活化，增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PC-9細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。厄洛替尼與吉非替尼兩藥有相同的喹唑啉母環(huán)，吉非替尼側(cè)鏈不對(duì)稱，而厄洛替尼的側(cè)鏈?zhǔn)晴R像對(duì)稱的，結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異導(dǎo)致兩藥物在血漿內(nèi)，腫瘤組織內(nèi)的分布，代謝，體外活性，毒性等方面有

6、所不同。這對(duì)于不同藥物對(duì)各種不同腫瘤的治療選擇上有重要參考意義。兩藥結(jié)構(gòu)的不同是否導(dǎo)致與FLNa相互作用的不同，進(jìn)而影響EGFR突變陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌對(duì)厄洛替尼的敏感性，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　方法：⑴Western bolt方法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中FLNa蛋白水平。⑵MTS比色分析法檢測(cè)厄洛替尼對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力的影響。⑶劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)厄洛替尼對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力的影響。⑷侵襲試驗(yàn)檢測(cè)厄洛替尼對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲能力的影響。⑸

7、Western blot檢測(cè)厄洛替尼對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 filamin A，p-EGFR， EGFR，p-ERK，和ERK水平，β-actin作為內(nèi)參。
　　結(jié)果：①采用Western blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞FLNa蛋白水平，ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行掃描，利用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果：PC-9/ctrl細(xì)胞中 FLNa的表達(dá)量（0.87±0.01）明顯高于 PC-9/FLNa（KD）細(xì)胞（0.25±0.01），

8、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。②MTS法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞IC50，結(jié)果：不同濃度的厄洛替尼作用下，其對(duì)PC-9/ctrl細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均高于PC-9/FLNa（KD）細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；厄洛替尼的 IC50值，PC-9/FLNa（KD）組細(xì)胞（0.39±0.01）明顯高于PC-9/ctrl組細(xì)胞（0.08±0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。PC-9/FLNa（KD）細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性更低。③

9、用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果：無(wú)藥物作用時(shí)， PC-9/FLNa（ KD）組細(xì)胞在6h、12h、18h的遷移率（16.49±0.86%，43.32±0.95%，50.00±0.00%）均明顯高于 PC-9/ctrl組（11.58±1.50%，28.68±1.48%，50.00±0.00%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；0.04μmol/L厄洛替尼作用時(shí)， PC-9/FLNa（ KD）組細(xì)胞6h、12h、18h的遷移

10、率（12.92±1.44%，30.35±1.07%，49.98±0.02%）明顯高于 PC-9/ctrl組細(xì)胞（6.36±0.99%，18.48±1.10%，24.22±0.05%），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。④侵襲試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果：無(wú)藥物作用時(shí)，PC-9/FLNa（KD）組穿膜的細(xì)胞數(shù)量(125.00±5.72)多于PC-9/ctrl組(63.00±5.46)，在0.04μmol/L厄洛替尼作用下的 PC-9/FLNa（KD）組穿膜

11、的細(xì)胞數(shù)量(86.00±4.09)明顯多于PC-9/ctrl組(29.00±3.21)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。⑤Western blot檢測(cè)0.01μmol/L厄洛替尼作用于兩組細(xì)胞0h、2h、4h后各蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果：PC-9/FLNa（ KD）組 p-EGFR的水平（0.37±0.01；0.31±0.01；0.28±0.00）均明顯高于PC-9/ctrl組（0.33±0.01；0.03±0.00；0.11±0.00

12、），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PC-9/FLNa（KD）組p-ERK的水平（0.98±0.00；0.57±0.00；0.79±0.01）均高于PC-9/ctrl組（0.89±0.01；0.25±0.01；0.45±0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴下調(diào)FLNa的表達(dá)促進(jìn)PC-9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；FLNa通過(guò)影響PC-9細(xì)胞EGFR的磷酸化水平，調(diào)控MAPK/ERK激酶的活化，進(jìn)而影響PC