油酸致A549細胞損傷模型建立及其對Sp-B影響研究.pdf

1、目的:
　　大量研究顯示油酸(oleic acid，OA)所致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）動物模型的病理學變化與與臨床極為相似，但其致傷機制尚不太明確，且國內(nèi)外關(guān)于OA致傷的體外模型層面研究較少。我們嘗試建立OA刺激致肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549細胞損傷的體外模型，并探討不同濃度OA損傷對A549細胞SP-B的影響。
　　方法:
　　1.實驗分組:A549細胞培養(yǎng)至3代后，融合率＞80％。(1

2、)對照組:不加入OA，替代以實驗組等量的DMEM（不含胎牛血清），37℃孵箱培養(yǎng)24h;(2) OA組:按照OA終濃度分別分為300umol/L、400 umol/L、500 umol/L及600 umol/L4個亞組，37℃孵箱培養(yǎng)24h; LPS組:(1)對照組:同OA對照組;(2)實驗組:按照0.1 ug/ml、1 ug/ml、10ug/ml及100ug/ml的LPS濃度分為4個實驗組，37℃孵箱培養(yǎng)24h;
　　2.光鏡觀

3、察細胞形態(tài)學變化，CCK-8法檢測細胞增殖活性:細胞長勢符合實驗要求后，按實驗分組濃度刺激。先用倒置顯微鏡，200倍鏡下觀察細胞形態(tài)學變化并拍照。加入CCK-8，采用GEN5軟件及酶標儀，進行OD值檢測。
　　3.ELISA檢測SP-B表達:各組細胞按4×104個/ml接種于96孔孔板中，5個復孔每組，共需接5組。每孔上清液于24h后收集，按ELISA試劑盒操作說明書對收集的上清液進行SP-B表達檢測分析。
　　4.West

4、ern Blot檢測SP-B分泌:細胞傳至3代以后，對上清液及細胞進行程序化處理，按照Western Blot檢測試劑盒操作說明書對收集的SP-B分泌及表達水平進行檢測。
　　5.統(tǒng)計學分析:統(tǒng)計學軟件采用SPSS16.0，有效數(shù)字保留小數(shù)點后2位，計量資料采用x±s形式表達，計量資料采用單因素方差分析。當P值小于0.05時，我們認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.細胞形態(tài)學變化:OA對照組A549細胞胞質(zhì)豐富

5、、呈多角形，細胞突起明顯，貼壁性生長，融合成片，無核固縮;300umol/L組，細胞胞體輕微變圓，體積略微縮小，突起逐漸減少，少量大小不均的顆粒開始出現(xiàn)于胞質(zhì)內(nèi);400 umol/L組，細胞胞體比較明顯的變圓，體積變小，有較多的突起變少，比較多大小不均的顆粒開始出現(xiàn)于胞質(zhì)內(nèi);500 umol/L及600 umol/L組，細胞器開始崩解，碎裂，基本無完整的細胞胞體，皺縮的細胞核開始大量出現(xiàn)。LPS各組隨LPS濃度增加與OA組形態(tài)學變化一致

6、。
　　2.CCK-8檢測細胞增殖活性:CCK-8檢測檢測顯示300、400、500和600μmol/LOA組OD值呈劑量依賴性下降，分別為空白對照組的87.0％、75.7％、64.4％和56.8％(P＜0.05)。CCK-8檢測檢測顯示0.1 ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/mlLPS組OD值呈劑量依賴性下降，分別為空白對照組的86.7％、75.4％、48.9％和44.0％(P＜0.05)。
　　3.

7、ELISA檢測上清液中SP-B表達:ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)SP-B表達量隨300、400、500和600μmol/LOA組呈劑量依賴性上升，分別為空白對照組的145.5％、187.4％、223.9％和235.3％(P＜0.05)，且符合S曲線分布(R=1.00)。除600μμmol/LOA組外，各組組間兩兩t檢驗比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)SP-B表達量隨0.1 ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及1

8、00ug/ml LPS組呈劑量依賴性上升，分別為空白對照組的102.7％、124.2％、152.5％和157.2％(P＜0.05)。部分組間兩兩t檢驗比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.Western Blot檢測SP-B分泌Western Blot檢測表明43KD SP-B表達量隨OA和LPS濃度升高逐步降低，43KD為完整Pro SP-B片段。
　　結(jié)論:
　　在模擬ALI實驗中，隨著細胞逐步破壞，S