肺癌A549放射抗拒細(xì)胞亞系的建立及其抗拒機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分非小細(xì)胞肺癌A549 放射抗拒細(xì)胞亞系的建立 目的：建立肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的放射抗拒模型。 方法：應(yīng)用兩種方案對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系進(jìn)行X射線照射：一組照射5 次，每次劑量600cGy；另一組照射15次，每次劑量200cGy。照射完成后對存活細(xì)胞單克隆化，分別命名為A549-S1和A549-S2，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)測定兩種細(xì)胞亞系及親本A549細(xì)胞的放射敏感性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期特征。并在放射抗拒亞系形成

2、后三個月再次利用克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗拒亞系細(xì)胞的放射敏感性。 結(jié)果：與親本A549細(xì)胞相比，A549-S1細(xì)胞顯示出明顯放射抗性，D0、Dq及N值增大，細(xì)胞存活曲線肩區(qū)增寬，在SF2水平上，放射抗性是A549的1.38倍，細(xì)胞的S期比例較A549細(xì)胞明顯增高，G0/G1期比例下降(P<0.05)。而A549-S2的放射敏感性與親本細(xì)胞相比稍增強(qiáng)，D0、Dq及N值均減小，細(xì)胞存活曲線肩區(qū)變窄，在SF2水平上，放射抗性是A549細(xì)胞的

3、0.84倍，細(xì)胞S期、G0/G1期比例較A549細(xì)胞減少，而G2/M期比例明顯增加(P<0.05)。三個月后克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A549-S1細(xì)胞仍然顯示明顯的抗拒性。 結(jié)論：A549細(xì)胞亞系放射抗拒的形成與不同照射方案有一定關(guān)系，得出的放射抗拒細(xì)胞亞系顯示出與親本不同的細(xì)胞周期特征，而且可以穩(wěn)定傳代，保持其放射抗拒性。 第二部分VEGF和Notch1 與非小細(xì)胞肺癌放射抗拒關(guān)系的研究 目的：通過研究Notch

4、1基因和VEGF在細(xì)胞株A549照射過程中的表達(dá)，探討在A549放射抗拒細(xì)胞株形成中Notch信號通路和VEGF的作用。 方法：將A549細(xì)胞隨機(jī)分為單純照射組和照射+VEGF抗體組。照射前利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測A549放射敏感性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期特征，RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測Notch1與VEGF基因和蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用X射線分別照射兩組A549細(xì)胞5 次，每次劑量600 cGy。每次照射后24 h檢

5、測Notch1與VEGF表達(dá)。五次照射完成后單克隆化得到兩個細(xì)胞亞系A(chǔ)549-S1和A549-S3，檢測其放射敏感性和細(xì)胞周期特征。利用直線相關(guān)分析兩實(shí)驗(yàn)組Notch1和VEGF表達(dá)與照射劑量之間的相關(guān)性。 結(jié)果：A549-S1與A549相比顯示出明顯放射抗拒性，細(xì)胞周期發(fā)生了相應(yīng)變化。　　　 Notch1表達(dá)與照射劑量成正相關(guān)，mRNA和蛋白水平相關(guān)系數(shù)R分別為0.9288、0.8648（P＜0.05）。VEGF表達(dá)與

6、照射劑量亦成正相關(guān)，mRNA和蛋白水平相關(guān)系數(shù)R分別為0.9223、0.9233（P＜0.05）。Notch1與VEGF表達(dá)間也高度相關(guān)，mRNA和蛋白水平相關(guān)系數(shù)分別是0.9041和0.8663（P均＜0.05）。.A549-S3放射敏感性和細(xì)胞周期特征無明顯變化，Notch1表達(dá)在照射過程中無顯著變化。 結(jié)論：經(jīng)過600cGy的5 次連續(xù)單純照射得到的A549細(xì)胞亞系較A549細(xì)胞對射線更加抗拒，顯示出與照射之前不同的細(xì)胞周