新型HOCl熒光探針發(fā)光檢測及其對A549細胞生長影響的初步研究.pdf

1、研究背景和研究目的:
　　活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是一種有氧代謝的副產(chǎn)物，主要包括超氧負離子，過氧化氫和羥基自由基，它們在生物體內(nèi)都具有不同的靶向物。ROS不僅能夠通過損傷脂類，蛋白質(zhì)和DNA誘導疾病的發(fā)生，同時也能夠作為信號分子調(diào)節(jié)生理和病理過程。
　　次氯酸(Hypochlorous acid，HOCl)是生物體內(nèi)重要的活性氧之一，在體內(nèi)主要由髓過氧化物酶和血管過氧化物酶1(Vas

2、cular peroxidase-1，VPOl)催化產(chǎn)生，能夠與多種物質(zhì)如蛋白質(zhì)，脂類，核酸等發(fā)生化學修飾反應。HOCl在人類免疫功能系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能，在炎癥部位HOCl濃度會明顯增加，有助于對入侵細菌和病原體進行破壞。但是，次氯酸或次氯酸鹽濃度過高會導致組織損傷和一系列疾病，如動脈硬化、關節(jié)炎甚至誘發(fā)癌癥等。因此設計合成具有專一性強、靈敏性高的新型HOCl熒光探針，建立應用于細胞內(nèi)HOCl的熒光顯微成像方法，以實現(xiàn)對細胞內(nèi)次氯酸濃度

3、變化的實時監(jiān)測是非常必要的。然而，到目前為止，能夠用于檢測HOCl的比率型熒光探針仍然少之又少。所報道的大部分HOCl熒光探針都是單一發(fā)射光譜，輸出的熒光信號很容易受到探針濃度，儀器敏感性等環(huán)境條件的干擾。因此設計合成一些新型有效的HOCl熒光探針具有重要的科學意義和應用前景。
　　近年來，癌癥的發(fā)病率和死亡率逐年增加，已經(jīng)成為中國人口的主要死因和重大公共衛(wèi)生問題。2015年，約400萬新發(fā)癌癥病例和300萬癌癥死亡病例發(fā)生在中國

4、，其中肺癌是最為常見的癌癥發(fā)生和最主要的癌癥死亡原因。全球最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)也顯示，在2012年，全球有約1.41千萬新發(fā)癌癥病例，820萬患者死于癌癥。其中57％的癌癥病例以及65％的癌癥死亡病例來自發(fā)展中國家。不論是發(fā)達還是發(fā)展中國家，肺癌是男性的首位癌癥死因。
　　肺炎是許多下呼吸道疾病以及肺癌早期所出現(xiàn)的一個關鍵特征，主要是由于肺吸入大量過敏原，環(huán)境污染物，微生物固定繁殖和吸煙所致。同時肺炎會引起吞噬細胞聚集，產(chǎn)生大量殺菌物

5、質(zhì)。其中產(chǎn)生的ROS和活性氮(RNS)發(fā)揮著關鍵作用。此外肺炎癥部位也有MPO的存在。異常濃度的HOCl能夠誘導細胞凋亡或直接引起細胞壞死。研究發(fā)現(xiàn)，HOCl或MPO/H2O2/Cl-系統(tǒng)可使體外肺細胞或體內(nèi)肺組織中3-氯酪氨酸和脂過氧化產(chǎn)物等的水平升高。HOCl能夠使A549細胞發(fā)生誘變。
　　因此，要抑制或治療稱之為癌癥之首的肺癌，亟需開發(fā)新型抗肺癌細胞增殖的藥物，本課題組針對次氯酸新合成了一系列新型熒光次氯酸探針，并從化學遺

6、傳學的角度出發(fā)，找到能夠明顯抑制A549細胞生長的小分子，初步研究其抑制A549細胞生長的機制，可以為抗癌藥物的研發(fā)提供新思路，為藥物靶點尋找提供新線索。
　　研究方法:
　　1)點掃描共聚焦顯微鏡檢測HOCl探針細胞內(nèi)的發(fā)光效果和光穩(wěn)定性;
　　2)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);
　　3) SRB法檢測細胞存活率;
　　4) LDH法檢測細胞壞死;
　　5) Hoechst33258染色檢測細胞凋亡;

7、r>　　6)吖啶橙(AO)染色法檢測細胞核斷裂;
　　7)免疫印跡實驗分析PARP切割水平;
　　8) TUNEL染色法檢測細胞凋亡;
　　9)體視顯微鏡分析CAN(7-Diethylamino-3-(2，3-dihydro-1H-perimidin-2-yl)-chromen-2-one，7-二乙氨基-3-（2，3-二氫-1H-perimidin-2-基）-苯并吡喃-2-酮）對雞胚尿囊膜(Chick chorioal

8、lantoic membrane，CAM)中腫瘤細胞成瘤性和血管生成的影響;
　　10)螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測Nrf2酶活性;
　　11) MPO(Myeloperoxidase)試劑盒檢測細胞內(nèi)HOCl水平變化。
　　實驗結果:
　　1) CAN等新型HOCl熒光探針在細胞內(nèi)具有良好的發(fā)光特性和光穩(wěn)定性;
　　2) CAN能夠檢測RAW264.7細胞中HOCl水平;
　　3) CAN不

9、與線粒體或溶酶體共定位;
　　4) CAN不影響人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖;
　　5) CAN體外誘導A549細胞凋亡;
　　6) CAN通過誘導細胞凋亡抑制腫瘤細胞生長;
　　7) CAN促進Nrf2酶活性增加;
　　8) CAN降低A549細胞內(nèi)HOCl水平。
　　實驗結論:
　　利用RAW264.7細胞，我們驗證了CAN等一系列新型HOCl熒光探針在細胞中具有良好的發(fā)光效果和光穩(wěn)定性，除CA

10、N可以誘導RAW264.7細胞死亡不適宜在細胞中檢測HOCl，其他探針都可以用于檢測RAW264.7細胞中內(nèi)源性的HOCl水平。此外，CAN能夠顯著抑制A549細胞生長并誘導細胞凋亡，但是對血管內(nèi)皮細胞存活率沒有影響，進一步我們以雞胚尿囊膜為模型，利用TUNEL染色證明，在體內(nèi)CAN可以通過細胞凋亡抑制腫瘤細胞生長，但是對正常的CAM血管生成沒有作用。CAN能夠降低細胞內(nèi)HOCl水平，這說明CAN可以通過直接螯合HOCl降低A549細胞