鼠瘧濕熱證與青蒿素哌喹抗性培育相關(guān)性的初步觀察.pdf

1、目的：
　　本研究在中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，綜合利用飲食、環(huán)境及瘧原蟲(chóng)感染的多因素方法模擬建立病證結(jié)合的鼠瘧濕熱證模型;分析濕熱因素對(duì)感染伯氏瘧原蟲(chóng)K173株小鼠原蟲(chóng)增長(zhǎng)的影響，掌握不同環(huán)境下感染小鼠體內(nèi)瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)規(guī)律的變化;在鼠瘧濕熱證模型上培育出具有一定抗性指數(shù)的青蒿素與哌喹的抗性株，觀察鼠瘧濕熱證模型是否會(huì)影響伯氏瘧原蟲(chóng)K173株對(duì)青蒿素和哌喹抗藥性的產(chǎn)生。
　　方法：
　　1.采用高糖高脂飲食加濕熱外環(huán)境的實(shí)驗(yàn)方

2、法對(duì)昆明小鼠進(jìn)行干擾，探索模型建立所需的溫度條件;給予高糖高脂飲食，并置于高溫高濕環(huán)境下一定時(shí)間后，腹腔接種伯氏瘧原蟲(chóng)K173株(P.b.K173)感染昆明小鼠，建立病證結(jié)合的鼠瘧濕熱證模型，觀察研究模型小鼠體重、肛溫和攝食飲水量的變化，精神、活動(dòng)、皮毛和大小便情況以及血清水通道蛋白4(AQP-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平，對(duì)鼠瘧濕熱證模型進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　2.觀察比較正常環(huán)境，濕熱環(huán)境和濕熱證小鼠在感染P.b.K1

3、73后瘧原蟲(chóng)感染率變化，采用酶聯(lián)免疫方法（ELISA法）檢測(cè)各組小鼠血清干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素4（IL-4）水平及其比值的變化。
　　3.采用藥物劑量遞增法進(jìn)行抗性培育，直到培育出有一定抗性程度的青蒿素和哌喹抗性蟲(chóng)株。在鼠瘧濕熱證模型上進(jìn)行P.b.K173青蒿素和哌喹的抗性培育，與正常環(huán)境下抗性培育同時(shí)進(jìn)行，每隔5代用Peters4天抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ED90并計(jì)算獲得抗性指數(shù)I90，觀察比較P.b.K173在不同條件下抗性

4、指數(shù)的變化，分析鼠瘧濕熱證模型對(duì)P.b.K173青蒿素及哌喹耐藥性產(chǎn)生的影響。
　　結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)采取高糖高脂飲食加濕熱外環(huán)境13天的造模方法，在未感染瘧原蟲(chóng)之前小鼠可見(jiàn)大便粘，小便黃，肛溫較高。接種P.b.K173后，小鼠體溫持續(xù)升高。造模結(jié)束后，模型小鼠出現(xiàn)體重減輕，肛溫升高，飲水量減少以及精神倦怠萎靡、活動(dòng)減少、皮毛無(wú)光澤、大便粘、小便黃、肛門紅腫的異常癥狀，符合小鼠濕熱證候辯證標(biāo)準(zhǔn)，并與臨床上濕熱證候癥狀及體

5、征接近。模型組小鼠血清AQP-4及TNF-α水平為3.15±0.33ng/mL,706.66±84.59pg/mL均高于正常小鼠2.46±0.12ng/mL，313.51±43.08pg/mL，其中TNF-α水平模型組比大腸桿菌濕熱證小鼠537.23±34.78pg/mL要高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，鼠瘧濕熱證小鼠機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)強(qiáng)烈。
　　2.觀察發(fā)現(xiàn)濕熱證和濕熱環(huán)境下小鼠的原蟲(chóng)感染率在感染早期較正常環(huán)境小鼠要低。對(duì)比

6、正常環(huán)境，濕熱證以及濕熱環(huán)境三組小鼠血清IFN-γ、血清IL-4、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率及NO水平的變化發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)水平均出現(xiàn)早期上升后期下降的現(xiàn)象。各組小鼠血清IFN-γ水平在感染后第4天達(dá)到峰值，分別為1091.51±73.60pg/mL，1186.02±41.14pg/mL，1112.77±43.23pg/mL。IL-4水平在感染后第6天達(dá)到峰值，分別為337.31±16.88pg/mL，333.32±18.63pg/mL，347.5

7、1±26.60pg/mL。濕熱證小鼠和濕熱環(huán)境小鼠在感染早期血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值比正常環(huán)境小鼠要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IFN-γ因子可能激活并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能抑制瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)，但后期IFN-γ、IL-4因子大量減少，巨噬細(xì)胞吞噬活性降低，原蟲(chóng)感染率爆發(fā)性增長(zhǎng)，最終導(dǎo)致小鼠死亡。
　　3.歷時(shí)六個(gè)月的1至20代抗性培育發(fā)現(xiàn)，培育至20代，常態(tài)組和濕熱證組青蒿素抗性株抗性指數(shù)I90分別為5.8

8、，2.7，青蒿素3天給藥劑量由185.88mg/kg增至478.67mg/kg，293.10mg/kg，表現(xiàn)為輕度抗性。常態(tài)組和濕熱證組哌喹抗性株抗性指數(shù)I90分別為10.9，5.2，常態(tài)組哌喹蟲(chóng)株表現(xiàn)出中度抗性，而濕熱證組仍為輕度抗性。說(shuō)明濕熱證在一定程度上減緩了P.b.K173對(duì)青蒿素及哌喹抗藥性的產(chǎn)生。
　　結(jié)論：
　　1.采用高糖高脂飲食、濕熱外環(huán)境及感染伯氏瘧原蟲(chóng)K173株的多因素疊加造模方法成功建立了病證結(jié)合的鼠