我國(guó)惡性瘧原蟲(chóng)地理株青蒿素抗性蟲(chóng)株的體外培育及其敏感性測(cè)定.pdf

1、世界衛(wèi)生組織推薦青蒿素及青蒿素衍生物的聯(lián)合用藥(ACT)為治療惡性瘧的首選用藥。由于青蒿素具有高效、快速和副作用小等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用已使全球瘧疾流行回升的嚴(yán)峻形勢(shì)得到了有效控制，瘧疾發(fā)病率和死亡率逐年回落。然而，已有人報(bào)道在柬埔寨西部出現(xiàn)了青蒿素抗性蟲(chóng)株，隨后在泰-柬、泰-緬等地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了青蒿素抗性蟲(chóng)株或?qū)η噍锼孛舾行韵陆档寞懺x(chóng)蟲(chóng)株。青蒿素抗性是個(gè)非常嚴(yán)峻的問(wèn)題，危及全球瘧疾防治工作。青蒿素抗性蟲(chóng)株一旦擴(kuò)散和失控，將會(huì)給全球帶來(lái)災(zāi)難性后

2、果。為應(yīng)對(duì)這一嚴(yán)峻形勢(shì)，迫切需要弄清楚青蒿素抗性相關(guān)的基因突變，鑒定潛在的青蒿素抗性相關(guān)的分子標(biāo)識(shí)，為惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素抗性蟲(chóng)株的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)提供分子標(biāo)識(shí)。
　　為鑒定瘧原蟲(chóng)青蒿素抗性相關(guān)的基因及其突變，本研究利用云南及中緬邊境地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)地理蟲(chóng)株，建立瘧原蟲(chóng)體外連續(xù)培養(yǎng)，并采用體外藥物壓力下培育抗性蟲(chóng)株的方法，培育了5株惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素抗性蟲(chóng)株，取得了以下結(jié)果：（1）惡性瘧原蟲(chóng)野生蟲(chóng)株的體外連續(xù)培養(yǎng)：建立野生蟲(chóng)株體外培養(yǎng)，首先需

3、要檢測(cè)和去除培養(yǎng)物中的支原體。體外培養(yǎng)物中的支原體，其代謝產(chǎn)物及特殊酶類(lèi)會(huì)影響瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)的建立。此外，支原體的基因組富含AT(61％～76%)，支原體污染會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)瘧原蟲(chóng)基因組的分析。為了建立惡性瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)中的支原體污染的檢測(cè)方法，本研究根據(jù)支原體16s和23s保守序列設(shè)計(jì)PCR引物，應(yīng)用巢式PCR檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)中的支原體。結(jié)果顯示，8份體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲(chóng)樣本，其PCR檢測(cè)支原體結(jié)果均呈陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后確認(rèn)為口腔

4、支原體污染。采用MRA方法處理瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)物，一周后所有樣本PCR檢測(cè)支原體結(jié)果均轉(zhuǎn)為陰性，表明惡性瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)物中支原體已被有效清除。（2）運(yùn)用微衛(wèi)星長(zhǎng)度多態(tài)性分析確定單一感染蟲(chóng)株：多重感染的蟲(chóng)株既不利于后續(xù)的基因分析,也不利于加藥培育前后蟲(chóng)株藥物敏感性差異的分析。本研究利用微衛(wèi)星位點(diǎn)ARA2、TA1、TA42、TA60、TA81、TA87、TA109、PFPK2、POLYA、PFG377的基因片段長(zhǎng)度多態(tài)性鑒別蟲(chóng)株是否為單一感染。共分析

5、了6株地理株及兩株標(biāo)準(zhǔn)株，結(jié)果顯示:五株地理株及兩株標(biāo)準(zhǔn)株為單一感染；另有一株地理株顯示為多重感染。（3）體外藥物壓力下青蒿素抗性蟲(chóng)株的培育：采用不斷提高藥物濃度的方法在體外培育青蒿素抗性蟲(chóng)株。惡性瘧原蟲(chóng)在六孔板中正常培養(yǎng),當(dāng)原蟲(chóng)密度達(dá)到5%時(shí)，在培養(yǎng)物中加入一定濃度的青蒿素。24小時(shí)后以薄血膜染色后計(jì)數(shù)感染細(xì)胞，計(jì)算感染率,如果原蟲(chóng)率＜5%，則換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；如果原蟲(chóng)率＞5%，則繼續(xù)加入含青蒿素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。初始加藥濃度

6、為50nM，然后按上述標(biāo)準(zhǔn)逐漸增加藥物濃度，直到獲得對(duì)青蒿素有較高抗性的蟲(chóng)株。在一年半的加藥培育周期中，5株惡性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株（SH1ART、SH2ART、SH3ART、SH4ART和SH5ART）分別經(jīng)歷了81、111、79、65和79次加藥培育；其中SH2ART蟲(chóng)株的最高青蒿素適應(yīng)生長(zhǎng)濃度已達(dá)到了1.5μM，比最初適應(yīng)濃度提高了30倍。（4）體外測(cè)定培育的惡性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株對(duì)青蒿素的敏感性：通過(guò)“生長(zhǎng)-藥物殺蟲(chóng)-撤藥-再燃”的方法和傳統(tǒng)IC

7、50、IC90的檢測(cè)方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)抗性培育前后的蟲(chóng)株的藥物敏感性差異。用“生長(zhǎng)-藥物殺蟲(chóng)-撤藥-再燃”的方法檢測(cè)加藥濃度最高的三個(gè)蟲(chóng)株，結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)加藥培育后的蟲(chóng)株與原始株比較，復(fù)燃時(shí)間均有所縮短；其中SH2ART蟲(chóng)株與原始蟲(chóng)株SH2有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值＜0.05。用傳統(tǒng)微量藥板法檢測(cè)SH2ART與SH2的IC50、IC90,測(cè)得SH2與SH2ART的IC50分別為19.7 nM、25.2 nM;IC90分別為25.1 nM、42.