ALEX1在乳腺癌中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、ALEX/ARMCX（ Arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X）蛋白是Arm蛋白家族的成員之一，因只具有一或二個Arm repeat結(jié)構(gòu)，不同于經(jīng)典Arm蛋白具有的6-13個Arm repeat結(jié)構(gòu)，而被單獨(dú)列為ALEX蛋白家族。其家族成員包括ALEX1、ALEX2和ALEX3?；虮磉_(dá)分析顯示ALEX1 mRNA在人類多種正常組織中高表達(dá)而在上皮組織來源的癌組織低

2、表達(dá)或不表達(dá)。ALEX1基因受CREB和Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)并能夠抑制人直腸癌細(xì)胞的克隆形成。這些研究表明ALEX1很可能在上皮來源的腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。目前，ALEX1在乳腺癌中的表達(dá)及其作用和機(jī)制仍不清楚，故本論文主要研究ALEX1在乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)水平及對乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等方面的影響及其分子機(jī)制。
　　第一部分：ALEX1在乳腺標(biāo)本中的表達(dá)分析
　　目的：檢測乳腺癌組織及

3、對應(yīng)癌旁組織中的ALEX1表達(dá)水平，比較兩者之間的表達(dá)是否存在差異，明確ALEX1與臨床病理特征是否具有相關(guān)性。
　　方法：應(yīng)用real-time PCR、免疫組化及western blot方法檢測乳腺癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織中ALEX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析免疫組化檢測的ALEX1的表達(dá)量與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分子分型之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:對62對乳腺癌及對應(yīng)癌旁臨床組織標(biāo)

4、本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示：ALEX1表達(dá)主要定位于胞漿。統(tǒng)計(jì)分析表明：乳腺癌組織ALEX1蛋白的表達(dá)水平低于乳腺癌旁組織中的表達(dá)（p<0.01)；進(jìn)一步對ALEX1的染色評分與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌中ALEX1的表達(dá)與病理分級（1 vs.3，p=0.026；2 vs.3，p=0.045），臨床分期（I vs. III，p=0.008；II vs. III，p=0.011），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（p=0.03）和分

5、子分型（Luminal A型vs. HER-2過表達(dá)型，p=0.02）有關(guān)，而與病人年齡、腫瘤大小和腫瘤類型無關(guān)（p>0.05）。此外，隨機(jī)抽取30對乳腺癌與癌旁組織利用real-time PCR進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)20例乳腺癌組織中ALEX1 mRNA的表達(dá)明顯低于對應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)（p<0.01）；隨機(jī)抽取6對乳腺癌與癌旁組織采用western blot對ALEX1蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：乳腺癌組織ALEX1蛋白表達(dá)水平均低于對應(yīng)的癌

6、旁組織中的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)ALEX1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，乳腺癌的病理分級、臨床分期越高，ALEX1的表達(dá)水平越低；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中ALEX1表達(dá)水平明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織，而且在乳腺癌的分子分型中乳腺癌HER-2過表達(dá)型組織中ALEX1的表達(dá)水平低于Luminal A型。
　　第二部分：ALEX1對乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　目的：研究過表達(dá)/

7、沉默ALEX1對乳腺癌細(xì)胞SK-BR3/MCF-7增殖、周期和凋亡的影響。
　　方法：Real-time PCR和western blot方法檢測ALEX1在正常乳腺細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D、SK-BR3、MDA-MB-231中表達(dá)情況，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測ALEX1亞細(xì)胞定位。過表達(dá)ALEX1慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞SK-BR3后，熒光顯微鏡觀察重組慢病毒LV5-ALEX1的感染效率，real-time

8、 PCR和western blot方法檢測ALEX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。利用合成的三條RNAi序列瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7后，用real-time PCR和western blot方法檢測ALEX1 mRNA和蛋白表達(dá)情況。過表達(dá)/沉默ALEX1后CCK8（Cell Counting Kit）檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡情況。
　　結(jié)果：Real-time PCR和western blot結(jié)果顯示：在乳腺癌各細(xì)胞

9、株中ALEX1的表達(dá)水平均低于正常乳腺細(xì)胞MCF-10A，但ALEX1在MCF-7細(xì)胞株中表達(dá)水平高于其他乳腺癌細(xì)胞株，在SK-BR3中表達(dá)水平最低且ALEX1蛋白定位于胞漿中。過表達(dá)ALEX1慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞SK-BR372h后，熒光顯微鏡觀察感染效率達(dá)90％以上；與對照組LV5-NC（LV5-Negative Control）相比，實(shí)驗(yàn)組LV5-ALEX1中ALEX1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增高。CCK8結(jié)果顯示：LV5-AL

10、EX1組感染LV5-ALEX1慢病毒48h到96h SK-BR3細(xì)胞生長明顯受到抑制（p<0.05）。Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LV5-ALEX1組凋亡細(xì)胞數(shù)量多于LV5-NC（p<0.05）。利用小RNA干擾技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h后，real-time PCR和western blot結(jié)果顯示三條RNAi序列中其中RNAi-2序列沉默ALEX1效果明顯，選擇作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分兩組：實(shí)驗(yàn)組SiALEX1和陰性對照

11、組SiCon。CCK8結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染SiALEX148 h到96h，MCF-7細(xì)胞生長強(qiáng)于陰性對照組SiCon（p<0.05）。Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：MCF-7細(xì)胞中SiALEX1組的凋亡細(xì)胞數(shù)量少于SiCon組（p<0.05）。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示：過表達(dá)/沉默ALEX1對乳腺癌細(xì)胞周期變化均沒有影響。
　　結(jié)論：過表達(dá)ALEX1抑制乳腺癌SK-BR3細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；沉默ALEX1促進(jìn)乳

12、腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。
　　第三部分：ALEX1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　　目的：深入研究ALEX1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　方法：Western blot方法檢測過表達(dá)/沉默ALEX1乳腺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測調(diào)控ALEX1的miRNAs。Western blot方法和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-590-5p調(diào)控ALEX1。然后分別以MCF-7和SK-B

13、R3乳腺癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在MCF-7細(xì)胞中將實(shí)驗(yàn)分為NC mimics組和miR-590-5P mimics組；SK-BR3細(xì)胞中分為NC inhibitor組和miR-590-5P inhibitor組，利用western blot方法檢測ALEX1及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。接下來，我們利用“功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)”在MCF-7細(xì)胞中將實(shí)驗(yàn)分為NC mimics+GV230-NC組、GV230-NC+miR-590-5P mimics組、 NC

14、 mimics+GV230-ALEX1和miR-590-5P mimics+GV230-ALEX1組；在SK-BR3細(xì)胞中分為NC inhibitor+SiCon組、SiCon+miR-590-5P inhibitor組、NC inhibitor+SiALEX1和miR-590-5P inhibitor+SiALEX1組，進(jìn)一步明確ALEX1受miR-590-5P調(diào)控誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示

15、：SK-BR3細(xì)胞中過表達(dá)ALEX1后，上調(diào)Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。MCF-7細(xì)胞中沉默ALEX1后，下調(diào)Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。Western blot方法和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示：miR-590-5p與ALEX13'-UTR結(jié)合調(diào)控ALEX1mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

16、在MCF-7細(xì)胞中與NC mimics組相比，miR-590-5p mimics組中，ALEX1、Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)。SK-BR3細(xì)胞中miR-590-5P inhibitor組與NC inhibitor對照組相比，ALEX1、Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)中顯

17、示外源性補(bǔ)充/沉默ALEX1能夠逆轉(zhuǎn)上述各凋亡蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：過表達(dá)ALEX1通過內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)SK-BR3細(xì)胞凋亡；沉默ALEX1通過內(nèi)源性凋亡通路抑制MCF-7細(xì)胞凋亡。ALEX1是miR-590-5P新的靶基因。ALEX1受miR-590-5P調(diào)控通過內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　第四部分：ALEX1在乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中作用機(jī)制的初探
　　目的：初步探明ALEX1在乳腺癌細(xì)胞上

18、皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用機(jī)制。
　　方法：在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231/MCF-7中過表達(dá)/沉默ALEX1后，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；細(xì)胞劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力；western blot檢測上皮間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)ALEX1后，細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎噙呅?；?xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組遷移距離明顯小于LV5-NC對照組；Transwell

19、結(jié)果顯示：細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯少于對照組；western blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中間質(zhì)類型標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)消失，Snail-1、Slug未見明顯變化，Twist表達(dá)水平降低；上皮類型標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平升高。乳腺癌MCF-7細(xì)胞中沉默ALEX1后，細(xì)胞形態(tài)由扁圓形變?yōu)樯斐鰝巫愕亩噙呅危患?xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組遷移距離明顯大于SiCon對照組；Transwell結(jié)果顯示：細(xì)胞穿膜數(shù)量

20、明顯多于對照組，western blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中上皮類型標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)消失，間質(zhì)類型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Twist表達(dá)水平升高，Snail-1和Slug表達(dá)未見明顯變化。
　　結(jié)論：過表達(dá)ALEX1能夠減弱MDA-MB-231侵襲遷移能力，誘導(dǎo)MDA-MB-231由間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化；沉默ALEX1能夠增強(qiáng)MCF-7侵襲遷移能力，誘導(dǎo)MCF-7由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。我們