慢性腎衰竭時炎癥對血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用.pdf

1、本研究分為三部分： 研究一、尿毒癥血清誘導(dǎo)人臍動脈平滑肌細(xì)胞成骨分化和鈣化的研究 目的：觀察尿毒癥血清對原代培養(yǎng)人臍動脈平滑肌細(xì)胞(HUASMCs)成骨分化和鈣化的影響。 材料與方法：收集40名健康人、40名非透析尿毒癥患者和45名透析尿毒癥患者血清，檢測生化指標(biāo)。組織植塊法原代培養(yǎng)HUASMCs。分別給予健康人血清(對照組)、透析(透析組)和非透析(非透析組)尿毒癥血清孵育。茜素紅S鈣沉積染色及甲氧-酚酞絡(luò)合酮

2、法檢測細(xì)胞層鈣鹽含量。RealtimePCR以及熒光定量法、Westernblot分別檢測骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、骨橋蛋白(OPN)和骨形成蛋白2(BMP2)基因以及蛋白表達(dá)。 結(jié)果：血清檢測結(jié)果顯示尿毒癥血清較健康對照血清存在高磷、高脂、高iPTH、高高敏C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)和血清白細(xì)胞介素-6(sIL-6)、低胎球蛋白A(FetuinA)，而透析組血清的甘油三酯、hsCRP、sIL-6較非透析血清高。與對照血清相

3、比，透析和非透析尿毒癥血清組均可使HUASMC發(fā)生鈣鹽沉積、上調(diào)BMP2以及BAP、OPN的表達(dá)，且透析血清作用更明顯。 結(jié)論：尿毒癥血清在體外能夠誘導(dǎo)HUASMCs成骨細(xì)胞分化和鈣化，提示血清中的高磷、高脂、高iPTH和炎癥性細(xì)胞因子、低FetuinA這些因素可能與尿毒癥相關(guān)的血管鈣化有關(guān)。而透析伴發(fā)的微炎癥狀態(tài)可能加速了這一過程。IL-6在血管鈣化中的作用值得進(jìn)一步深入研究。 研究二、白細(xì)胞介素6對體外培養(yǎng)人臍動脈平

4、滑肌細(xì)胞成骨分化、鈣化的影響及可能的信號通路研究 目的：研究白細(xì)胞介素6(IL-6)對體外培養(yǎng)人臍動脈平滑肌細(xì)胞(HUASMCs)成骨分化、鈣化的作用及可能的信號通路。 材料與方法：組織植塊法原代培養(yǎng)HUASMCs。培養(yǎng)基加入不同濃度(10ng/ml、50ng/ml)重組人IL-6(rhIL-6)孵育細(xì)胞，設(shè)空白對照組。茜素紅S鈣沉積染色及甲氧-酚酞絡(luò)合酮法檢測細(xì)胞層鈣鹽含量。RealtimePCR以及熒光定量法、Wes

5、ternblot分別檢測骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、骨橋蛋白(OPN)和骨形成蛋白2(BMP2)基因以及蛋白表達(dá)。凝膠遷移滯后實驗(EMSA)檢測成骨細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子Cbfal的結(jié)合活力、以及分別應(yīng)用p38-MAPK和PKC抑制劑SB203580、DHC后Cbfal的結(jié)合活力。 結(jié)果：rhIL-650ng/ml誘導(dǎo)12d，細(xì)胞基質(zhì)層茜素紅S染色陽性，同一時間點對照組細(xì)胞染色陰性。與對照組相比，rhIL-610ng/ml以及

6、50ng/ml刺激3、6、9和12d，細(xì)胞層鈣鹽含量呈時間、劑量依賴地增加。IL-610ng/ml刺激早期(12h和24h)，BMP2及BAPmRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)；刺激晚期(24h和72h)，OPN及OPGmRNA和蛋白水平上調(diào)；刺激6h，Cbfal結(jié)合活力增加；DHC能夠部分抑制IL-6誘導(dǎo)的Cbfal結(jié)合活力的增加；SB203580似乎對Cbfal的結(jié)合活力沒有影響。 結(jié)論：IL-6體外能夠誘導(dǎo)HUASMCs發(fā)生鈣化和成骨

7、細(xì)胞分化，這可能是臨床觀察到IL-6與血管鈣化相關(guān)的機(jī)制之一;IL-6刺激以后細(xì)胞OPG表達(dá)上調(diào)，推測VSMCs的OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)可能參與了IL-6介導(dǎo)的血管鈣化過程；IL-6的這一作用可能與細(xì)胞內(nèi)PKC通路的活化有關(guān)。 研究三、骨形成蛋白2基因siRNA靶向抑制對體外培養(yǎng)人臍動脈平滑肌細(xì)胞成骨分化及鈣化的影響 目的：研究骨形成蛋白2(BMP2)基因小干擾RNA(siRNA)靶向抑制后，對體外培養(yǎng)人臍動脈

8、平滑肌細(xì)胞(HUASMCs)發(fā)生白細(xì)胞介素6(IL-6)誘導(dǎo)后鈣化及成骨分化的影響。 材料與方法：HUASMCs組織植塊法原代培養(yǎng)。建立RNA干擾(RNAi)實驗平臺：FAM標(biāo)記陰性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，realtimePCR檢測靶基因4條候選siRNA抑制率，找出抑制率＞70％者。轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染組)和模擬轉(zhuǎn)染(對照組)HUASMCs均予重組人白細(xì)胞介素6(rhIL-6)10nl/ml刺激，realtimePCR檢測兩組細(xì)胞在孵育12h

9、及48h時BMP2、骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、骨鈣素(OC)及骨橋蛋白(OPN)mRNA表達(dá)水平。將IL-6濃度調(diào)整至50ng/ml，甲氧酚酞絡(luò)合酮法檢測上述兩組細(xì)胞及空白對照組(模擬轉(zhuǎn)染，無IL-6刺激)在基線、孵育2d、4d及6d時細(xì)胞層鈣鹽含量，以總蛋白含量校正。 結(jié)果：建立了合適的HUASMCsBMP2基因RNA干擾平臺。與對照組相比，轉(zhuǎn)染組孵育12h時，BMP2及BAPmRNA水平下降(分別為0.2042±0.00

10、69、0.1350±0.0093)；孵育48h，OC及OPN水平亦降低(分別為0.2896±0.0176、0.2533±0.0211)。與空白組相比，對照組細(xì)胞層鈣鹽含量在孵育2d(3.89±0.3162mmol/g)及4d(1.95±0.2241mmol/g)時升高。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞層鈣鹽含量在孵育2d(1.95±0.2472mmol/g)低于對照組，但高于空白組(1.11±0.2573mmol/g)；4d(1.17±0.2368mmol/