裂殖酵母中Dma1通過泛素化修飾Tip1-CLIP-170參與調(diào)控細(xì)胞極性生長的分子機(jī)制研究.pdf

1、在裂殖酵母S.pombe中，CLIP-170家族蛋白Tip1作為微管末端示蹤蛋白，能夠監(jiān)督微管使其沿著細(xì)胞的縱軸生長。另外，Tip1也參與運(yùn)輸細(xì)胞極性因子到細(xì)胞末端。tip1Δ會導(dǎo)致細(xì)胞彎曲甚至分叉，而過表達(dá)Tip1會導(dǎo)致細(xì)胞不能從單極生長向雙極生長轉(zhuǎn)變。人類腫瘤抑制因子Chfr同源蛋白Dma1是紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白和胞質(zhì)分裂的抑制因子，研究發(fā)現(xiàn)它會泛素化修飾SIN(septationinitialnetwork)信號途徑中的骨架蛋白Sid

2、4，導(dǎo)致Plo1激酶不能定位到SPB(spindlepolebody)，從而抑制SIN信號途徑和阻止胞質(zhì)分裂。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室在采用串聯(lián)親和純化方法純化Dma1蛋白復(fù)合體時，發(fā)現(xiàn)Tip1總是存在于此復(fù)合體中，定位研究顯示Dma1和Tip1在細(xì)胞末端都有定位。本研究發(fā)現(xiàn)，Dma1和Tip1在細(xì)胞末端共定位，且在胞內(nèi)有直接相互作用。我們還發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白的體外相互作用依賴于Dma1的FHA結(jié)構(gòu)域，并且Dma1結(jié)合被磷酸化的Tip1。

3、我們的研究發(fā)現(xiàn)Tip1的泛素化修飾依賴于Dma1，而且Dma1的E3泛素連接酶活性和正確定位對于Tip1的泛素化都是必須的。缺失Dma1不會明顯影響Tip1的蛋白水平，但影響Tip1的半衰期。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，依賴于Dma1的Tip1泛素化修飾在S期顯著增強(qiáng)，且發(fā)生在細(xì)胞末端。
　　 我們通過生化的手段對Dma1與Myo52以及Dph1在參與Tip1降解中的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，缺失Myo52或Dph1會導(dǎo)致泛素化形式的Tip

4、1累積，而缺失Dma1后，泛素化形式的Tip1均消失。Dma1與Myo52不存在體外直接相互作用，且Dma1也不影響Myo52和Tip1的相互作用。
　　 我們還發(fā)現(xiàn)Dma1總是定位在細(xì)胞生長端，且這種末端定位受到肌動蛋白斑的調(diào)節(jié)。肌動蛋白斑通過調(diào)控Dma1的末端定位進(jìn)而影響Dma1對Tip1的調(diào)控。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，缺失Tip1使細(xì)胞變長，而缺失Dma1或者M(jìn)yo52會導(dǎo)致細(xì)胞變短。
　　 綜上所述，本研究具體闡明了D