Gli2通過FoxM1調(diào)控KIF20A影響肝癌細胞增殖的分子機制.pdf

1、研究背景及目的：
　　肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一且預后不良。腫瘤的快速增殖、耐藥、復發(fā)和轉(zhuǎn)移是阻礙肝癌治愈的主要原因，但內(nèi)在的腫瘤發(fā)生機制并未得到全面解釋；研究證實肝癌的發(fā)生發(fā)展是由一系列基因的累積性改變所導致的。因此，針對腫瘤相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的異常改變進行深入研究，將有助于發(fā)掘重要的分子靶點，進而開展針對腫瘤特異性生物分子（基因和/或蛋白）的高效靶向治療。

2、Hedgehog（Hh）信號通路的異常激活在腫瘤惡性增殖中起重要作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)Hh通路的主要組分（Shh、Ptch1、SMO、Gli1及Gli2）在肝癌細胞中異?；罨种破湫?yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gli2的表達能顯著削弱體外培養(yǎng)肝癌細胞的增殖能力。但是 Gli2影響肝癌增殖的具體分子機制還待進一步明晰。腫瘤細胞的增殖與細胞有絲分裂有關(guān)，有絲分裂相關(guān)驅(qū)動蛋白(Kinesins)在腫瘤細胞有絲分裂過程中具有重要作用。Hh-Gli2通路對腫瘤增

3、殖的促進作用是否通過調(diào)控并依賴有絲分裂相關(guān)驅(qū)動蛋白基因的表達來實現(xiàn)是本項研究的論證重點，研究從生物信息學、分子、細胞生物學以及臨床隊列等多層次進行探索和驗證，試圖闡明有絲分裂相關(guān)驅(qū)動蛋白 KIF20A受Hh-Gli2調(diào)控的分子機制，并證明Gli2-KIF20A信號軸在調(diào)控肝癌細胞惡性增殖過程中的重要作用及靶點價值。本研究的開展有助于明晰肝癌細胞惡性增殖的分子機制，為未來應(yīng)用于肝細胞癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：

4、　　第一部分：KIF20A是Hedgehog信號通路的下游靶基因
　　1、Hh信號通路在調(diào)控細胞周期及細胞增殖過程中起重要作用，為研究抑制Hh信號通路后肝細胞癌基因表達譜的變化，首先利用real-time PCR和Westernblot篩選出Gli2高表達的肝癌細胞系，并分別使用cyclopamine(SMO抑制劑)及GANT61(Gli1/2抑制劑)分別抑制Hh通路的上下游信號。通過Microarray技術(shù)尋找受Hh通路抑制影響

5、的靶基因簇
　　2、在NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中檢索已公開的肝癌表達譜芯片數(shù)據(jù)集，進行差異表達基因的大范圍meta分析，通過兩種meta分析的方法確定在肝癌組織中顯著高表達的基因。再將meta結(jié)果與受Cyclpamine及GANT61抑制的基因列表進行交集以確定在肝癌中異常高表達且受 Hh通路調(diào)控的基因，并通過 real-time PCR技術(shù)驗證。
　　3、為進一步研究是否 KIF20A受 Shh-Gli2通路的調(diào)控。在 Gl

6、i2高表達的HCC-LM3及 MHCC-97H細胞中干擾 Gli2的表達或利用 Hh通路抑制劑（Cyclpamine及GANT61）處理，之后利用Western bolt檢測KIF20A的蛋白表達情況。在另外兩株Gli2相對低表達的HepG2及Huh7細胞中轉(zhuǎn)染Gli2表達質(zhì)粒或使用N-shh處理后利用Western bolt檢測KIF20A的表達。為明確N-Shh是否通過Gli2調(diào)控KIF20A的表達，在N-shh存在的培養(yǎng)條件下抑制

7、HepG2中Gli2的表達，之后利用Western bolt檢測KIF20A蛋白水平變化。
　　第二部分：轉(zhuǎn)錄因子Gli2通過活化FoxM1調(diào)控KIF20A的表達
　　1、為進一步研究Gli2是否通過激活KIF20A的啟動子區(qū)來調(diào)控KIF20A的表達。我們構(gòu)建了偶聯(lián)熒光素報告基因的KIF20A啟動子區(qū)。利用Dual-luciferase檢測增加或抑制Gli2表達后，KIF20A啟動子區(qū)偶聯(lián)熒光素信號的變化。
　　2、為

8、確定Gli2是否通過與KIF20A啟動子區(qū)直接相互作用調(diào)控KIF20A的表達，通過生物信息學預測 Gli2在KIF20A啟動子區(qū)的潛在結(jié)合位點，并利用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）檢測這些結(jié)合位點的有效性。
　　3、對 ChIP驗證的含有潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的啟動子區(qū)（ FoxM1或KIF20A）進行分段克隆，利用Dual-luciferase分析以確定ChIP所驗證的啟動子區(qū)結(jié)合位點是否具有功能。
　　第三部分：Gli2-

9、KIF20A信號軸調(diào)控肝癌細胞的增殖及細胞周期進程
　　1、為研究KIF20A在肝癌細胞中所起的生物學作用，利用miRNAi-KIF20A干擾質(zhì)粒抑制HepG2及HCC-LM3細胞中KIF20A的表達，并通過細胞增殖相關(guān)實驗評價KIF20A對肝癌細胞增殖的影響。
　　2、為研究抑制KIF20A表達影響肝癌細胞增殖的機制，采用流式細胞分析檢測KIF20A表達抑制后細胞周期分布的變化。為確定KIF20A干擾后對HepG2細胞胞質(zhì)

10、分裂的影響，利用共聚焦實時活細胞拍攝技術(shù)及熒光顯微技術(shù)做進一步分析。
　　3、為驗證Gli2促進肝癌細胞周期進程是否需要依賴下游KIF20A的表達，在Gli2過表達的肝癌細胞中，利用miRNAi干擾KIF20A的表達并通過克隆形成、流式細胞學實驗分析肝癌細胞增殖能力的變化。
　　4、為進一步明確Gli2-KIF20A信號軸在肝癌細胞增殖中的重要性，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了三株分別穩(wěn)定表達（shRNA-control，shRN

11、A-Gli2， shRNA-KIF20A）的HCC-LM3細胞，并建立腫瘤裸鼠皮下移植瘤模型。觀察移植瘤在體內(nèi)的增殖情況。
　　第四部分：Gli2、FoxM1及KIF20A在肝癌組織中異?；罨@著影響臨床預后
　　1、為驗證體外及體內(nèi)研究的結(jié)果，我們通過免疫組化技術(shù)檢測了Gli2, FoxM1及KIF20A在臨床肝癌樣本及其對應(yīng)非癌組織中的表達情況。使用“德國半定量”評分法對表達量進行評分。同時，通過Western blo

12、t在隨機選取的冰凍樣本中驗證免疫組化分析結(jié)果。
　　2、利用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗分析了Gli2、FoxM1和KIF20A三種基因在肝癌中表達的相關(guān)性。并采用卡方檢驗或fisher確切概率卡方檢驗分析Gli2, FoxM1, KIF20A與臨床病理特征間的相關(guān)性。
　　3、為研究Gli2、FoxM1、KIF20A的表達對肝癌患者生存預后的影響，利用Kaplan-Meier生存曲線分別分析了三個基因的高低表達對患者總生

13、存（OS）及無病生存（DFS）期的影響，并與其他因素同時納入多因素COX比例風險回歸模型確定能顯著影響患者預后的獨立風險因素。
　　結(jié)果：
　　第一部分：KIF20A是Hedgehog信號通路的下游靶基因
　　1、轉(zhuǎn)錄因子Gli2在HCC-LM3及MHCC-97H細胞中相對高表達，在HepG2中相對低表達，在 Bel-7402, Huh7及 SK-Hep1細胞呈中等表達水平。利用cyclopamine及GANT61抑制

14、Hh信號通路后，寡核苷酸表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)有335個基因的表達出現(xiàn)共同下調(diào)(DiffScore<-50)。
　　2、依據(jù)入組標準共納入6項公開發(fā)表的肝癌表達譜芯片數(shù)據(jù)集進行 meta分析，meta分析確定175個基因在肝癌組織中顯著高表達。將Microarray分析發(fā)現(xiàn)的335受cyclopamine及GANT61抑制的基因與meta分析的175個基因進行交集，發(fā)現(xiàn)7個Hh潛在靶基因在肝癌細胞中異?；罨?，其中KIF20A屬于驅(qū)動蛋

15、白家族，其與細胞的有絲分裂及增殖密切相關(guān)。
　　3、經(jīng) cyclopamine, GANT61處理或轉(zhuǎn)染 Gli2-shRNA后，HCC-LM3及MHCC-97H細胞的KIF20A蛋白表達量顯著下降。HepG2及Huh7細胞經(jīng)N-shh刺激或轉(zhuǎn)染Gli2-myc后KIF20A蛋白表達水平顯著增高。然而，當在HepG2中抑制Gli2的表達后阻斷了N-shh對KIF20A的刺激作用，證明N-shh需要通過Gli2調(diào)控KIF20A的表達

16、。
　　第二部分：轉(zhuǎn)錄因子Gli2通過活化FoxM1調(diào)控KIF20A的表達
　　1、在 HepG2細胞中過表達外源性的 Gli2后顯著增強了 KIF20A及 Bcl2的啟動子區(qū)偶聯(lián)熒光素酶表達。而在HCC-LM3細胞中抑制Gli2的表達后顯著抑制了KIF20A及Bcl2的啟動子區(qū)偶聯(lián)熒光素酶表達。
　　2、通過生物信息學在線分析軟件 MatInspector professional version7.2(http:/

17、/www.genomatix.de/)未發(fā)現(xiàn)KIF20A啟動子區(qū)存在Gli2潛在結(jié)合位點。但是，在KIF20A的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個轉(zhuǎn)錄因子FoxM1的潛在結(jié)合位點（2個保守結(jié)合位點及1個周期蛋白相關(guān)保守區(qū)域CHR），而在FoxM1的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個潛在的Gli2結(jié)合位點。 ChIP實驗證實Gli2可以結(jié)合在FoxM1的啟動子區(qū)（轉(zhuǎn)錄起始點上游-2165’-TCGCCACCCACG-3’-204）。FoxM1可通過周期蛋白相關(guān)保守區(qū)域C

18、HR（轉(zhuǎn)錄起始點下游+3345’-TTTAAA-3’+349）結(jié)合KIF20A的啟動子。
　　3、將 FoxM1及 KIF20A的啟動子區(qū)進行分段克隆入熒光素酶報告載體, Dual-luciferase分析證實ChIP驗證的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點均具有功能。
　　第三部分：Gli2-KIF20A信號軸調(diào)控肝癌細胞的增殖及細胞周期進程
　　1、利用Western blot篩選出兩個在HepG2及HCC-LM3細胞中均能有效干擾

19、KIF20A表達的質(zhì)粒。干擾KIF20A表達后HepG2及HCC-LM3細胞的增殖速率及平板細胞克隆形成能力明顯減弱。
　　2、細胞周期分析發(fā)現(xiàn)在HepG2及HCC-LM3細胞中干擾KIF20A表達后，導致細胞周期分布表現(xiàn)為G2/M及多核細胞比例的增加。免疫熒光及共聚焦實時活細胞拍攝技術(shù)發(fā)現(xiàn)干擾KIF20A表達后，肝癌細胞在有絲分裂后期分裂環(huán)內(nèi)陷出現(xiàn)障礙，最終導致胞質(zhì)分裂失敗。
　　3、在HepG2細胞中過表達Gli2可增強

20、細胞增殖及克隆形成的能力，增加CyclinD1 CyclinE2, CyclinB1的表達，但干擾KIF20A后由Gli2誘導的細胞增殖效應(yīng)便被阻斷了。
　　4、干擾Gli2及KIF20A后均能顯著抑制裸鼠移植瘤的增殖能力。相應(yīng)的， Western blot及IHC實驗證實抑制Gli2的表達后FoxM1, KIF20A,細胞周期調(diào)控蛋白（如CyclinD1, CyclinE2及CyclinB1）及細胞增殖標志物Ki67的表達均受到

21、顯著抑制。
　　第四部分：Gli2、FoxM1及KIF20A在肝癌組織中異?；罨@著影響臨床預后
　　1、免疫組化法檢測Gli2, FoxM1和KIF20A在肝癌組織中的陽性率分別達到43.9％、56.1%及51.4%，并且三者在肝癌組織中的表達量顯著高于癌旁非腫瘤組織。Western blot實驗檢測三者的表達趨勢與免疫組化實驗一致。
　　2、Gli2, FoxM1及KIF20A在肝癌中兩兩表達呈正相關(guān)。高表達的G

22、li2與CA-199水平、腫瘤直徑、病理分級、脈管侵犯及HBV感染相關(guān)；高表達的FoxM1與病理分級有關(guān)；高表達的 KIF20A與腫瘤直徑、病理分級、脈管侵犯、HBV感染及TNM分期有關(guān)。
　　3、單因素分析顯示腫瘤直徑、病理分級、脈管侵犯、TNM分期、Gli2、FoxM1及KIF20A表達顯著影響OS及DFS。納入多因素COX比例風險回歸模型后腫瘤直徑、病理分級、Gli2、 FoxM1及KIF20A表達是肝癌無病生存期的獨立預后

23、因素，而腫瘤直徑、病理分級、脈管侵犯、Gli2及KIF20A表達是肝癌總生存的獨立預后因素。
　　結(jié)論：
　　1、抑制Hh信號通路可顯著抑制驅(qū)動蛋白基因KIF20A的表達，且KIF20A的mRNA水平在肝癌組織中異常升高。轉(zhuǎn)錄因子Gli2介導了Hh通路對KIF20A表達的調(diào)控。
　　2、在肝癌細胞中 Gli2轉(zhuǎn)錄調(diào)控 KIF20A的表達，且 Gli2能直接轉(zhuǎn)錄激活FoxM1，活化的FoxM1再結(jié)合在KIF20A啟動子C