輪狀病毒VP8-蛋白與組織血型抗原的結(jié)合特性研究.pdf

1、目的:通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)六個(gè)輪狀病毒(rotavirus，RVs)株(Rotateq-P[8]、Rotateq-P[5]、Rotarix、RRV、LLR、P[14])的VP8*蛋白，以酶免疫分析實(shí)驗(yàn)(Enzyme immune assays，EIA)為基礎(chǔ)建立的唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)及寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究不同P基因型毒株VP8*蛋白與組織血型抗原(Histo-blood group antigens，HBGAs)的結(jié)合特性，為進(jìn)一步研究RVs-VP

2、8*蛋白的功能特性、HBGAs在RVs感染過(guò)程中的作用及新型RVs疫苗和防治藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)從Genbank中檢索RVs疫苗Rotateq、Rotarix及Rotashield相關(guān)病毒株的VP8*基因序列，并進(jìn)行基因合成;(2)從RVs疫苗rotorway（羅特威）提取病毒株LLR核酸，用隨機(jī)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增;(3)P[14]型輪狀病毒株核酸，為本實(shí)驗(yàn)從患兒糞便標(biāo)本提取所得;(4)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)P

3、CR反應(yīng)擴(kuò)增6個(gè)病毒株的VP8*區(qū)基因序列，克隆至表達(dá)載體pET-30a;(5)測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-VP8*轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用HisTrapTMFF親和層析柱純化，通過(guò)SDS-PAGE電泳及Western-blot鑒定;(6)通過(guò)唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析不同病毒株VP8*蛋白與攜帶不同HBGAs表型唾液的結(jié)合特性;(7)根據(jù)寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析不同病毒株VP8*蛋白與合成寡糖A、B

4、、Lea、Leb、Lex、Ley、PreⅠ、PreⅡ、H1、H2、H3的結(jié)合特性。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了6個(gè)RVs株VP8*編碼區(qū)的重組表達(dá)質(zhì)粒:pET-30a-Rotateq-P[8]-VP8*、 pET-30a-Rotateq-P[5]-VP8*、pET-30a-Rotarix-VP8*、 pET-30a-RRV-VP8*、 pET-30a-LLR-VP8*、pET-30a-P[14]-VP8*。(2)成功表達(dá)了6個(gè)RV

5、s株的重組VP8*蛋白:His-Rotateq-P[8]-VP8*、 His-Rotateq-P[5]-VP8*、 His-Rotarix-VP8*、His-RRV-VP8*、His-LLR-VP8*、His-P[14]-VP8*，大小約為26kDa。(3)重組蛋白R(shí)otateq-P[8]-VP8*及Rotarix-VP8*可以與A、B、AB及O型分泌型唾液結(jié)合，不與非分泌型唾液結(jié)合;重組蛋白P[14]-VP8*與A、AB型唾液有明顯結(jié)

6、合，與其它表型唾液均不結(jié)合;重組蛋白His-Rotateq-P[5]-VP8*、His-RRV-VP8*、His-LLR-VP8*與唾液不結(jié)合。(4)重組蛋白R(shí)otateq-P[8]-VP8*及Rotarix-VP8*可以與H1型HBGAs結(jié)合，重組蛋白P[14]-VP8*與A型HBGAs特異性結(jié)合，重組蛋白His-Rotateq-P[5]-VP8*、His-RRV-VP8*、His-LLR-VP8*與各型HBGAs及唾液均不結(jié)合。

7、r>　　結(jié)論:(1)本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了不同P基因型RVs株的VP8*蛋白;(2)首次構(gòu)建了唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)與寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)用于輪狀病毒VP8*蛋白與組織血型抗原的結(jié)合特性研究;(3)RVs VP8*蛋白與HBGAs的結(jié)合呈現(xiàn)株特異性，P[8]型RVs的VP8*蛋白與H1型HBGAs結(jié)合，能夠與分泌型唾液結(jié)合，不與非分泌型唾液結(jié)合;P[14]型RVs VP8*蛋白特異性結(jié)合A型HBGAs，能夠與A型和AB型唾液結(jié)合，不與其它表型唾