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文檔簡介
1、目的:為了探究iNKT細胞對類風濕關節(jié)炎(RA)免疫平衡狀態(tài)的影響,我們構(gòu)建了RA小鼠模型,檢測iNKT細胞頻率,Th1/Th2/Th17亞群和細胞因子。并在體外誘導胸腺淋巴細胞向iNKT細胞分化,過繼輸注細胞至RA小鼠,探究iNKT細胞對RA小鼠的干預作用;對Th1/Th2/Th17免疫失衡的影響;并探討iNKT細胞對RA的影響機制,為今后RA發(fā)病機制和治療方法的探究提供新的理論依據(jù)。
方法:
1.構(gòu)建類風濕關節(jié)炎
2、小鼠模型及鑒定
hGPI325-339、hGPI469–483多肽片段1:1混合,與完全弗氏佐劑充分乳化后,于DBA/1小鼠尾根部多點皮下注射,百日咳毒素0h、48h腹腔注射加強免疫進行造模。
以健康小鼠為對照,觀察小鼠體重變化、足踝關節(jié)紅腫情況;足踝關節(jié)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining, HE)染色觀察炎細胞浸潤情況;流式細胞技術(Fluorescence-activated ce
3、ll sorting,F(xiàn)ACS)檢測外周血、脾臟iNKT細胞頻率和Th1/Th2/Th17亞群比率,微量樣本多指標流式蛋白定量技術(Cytometric Bead Array,CBA)檢測血清細胞因子IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-6的水平變化。
2.胸腺來源的iNKT細胞的誘導及免疫生物學功能檢測
分離DBA/1小鼠胸腺,獲取淋巴細胞懸液,添加IL-2、IL-4、α-Ga
4、lCer,體外刺激誘導iNKT細胞。一周后,免疫磁珠分選技術(Magnetic Cell Sorting,MACS)分離iNKT細胞,F(xiàn)ACS檢測iNKT細胞頻率、細胞亞群情況,CBA法檢測培養(yǎng)上清中細胞因子水平。用細胞膜深紅色熒光探針(DiR)染色細胞,尾靜脈過繼輸注至正常小鼠,小動物活體成像系統(tǒng)觀察細胞分布,并對小鼠體重、皮毛、皮膚、活動和姿勢進行評價,確定其輸注的安全性。
3.觀察胸腺來源的iNKT細胞對RA小鼠的Th1
5、/Th2/Th17的影響
應用胸腺來源的iNKT細胞對RA模型小鼠進行干預,以α-GalCer作為陽性對照,觀察各組小鼠體重變化和足踝關節(jié)腫脹變化情況;關節(jié)組織HE染色法觀察炎細胞浸潤情況的變化;FACS檢測iNKT細胞頻率和細胞亞群變化,CBA法檢測各組小鼠各期血清中細胞因子水平變化。
結(jié)果:
1.RA模型小鼠較健康對照組體重增長緩慢(P<0.05);RA模型小鼠在造模第7天,足趾最先出現(xiàn)紅腫,在造模第1
6、4天紅腫達到高峰,后逐漸緩解;HE觀察發(fā)現(xiàn)足踝關節(jié)有大量炎細胞浸潤。炎癥高峰期iNKT細胞頻率下降明顯(P<0.05);炎癥早期Th1和Th17亞群上升明顯(P<0.05),炎癥中后期Th2亞群上升明顯(P<0.05);炎癥高峰期血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-6水平顯著升高(P<0.05);RA小鼠iNKT頻率與TNF-α、IL-6、Th1亞群水平呈負相關。
2.胸腺淋巴細胞以CD4+CD8+細胞
7、為主,體外刺激誘導一周后,iNKT細胞頻率為7.07%?1.12%,經(jīng)純化后頻率為63.37%?5.84%。分離后的細胞以Th2細胞為主,受刺激后主要分泌IL-4。細胞輸注至正常小鼠后多分布在肝臟、脾臟,小鼠各項評分正常。
3.α-GalCer和細胞輸注均可顯著改善RA模型小鼠體重增長緩慢、關節(jié)腫脹情況(P<0.05);足踝關節(jié)炎細胞浸潤減少;iNKT細胞頻率上升;Th1/Th2/Th17亞群及細胞因子紊亂現(xiàn)象得到一定糾正。<
8、br> 結(jié)論:
1.GPI混合肽段誘導的RA模型小鼠在iNKT細胞和Th1/Th2/Th17細胞免疫病理方面與RA患者較為接近,可作為RA免疫機制研究和治療的良好工具。
2.胸腺雙陽性T細胞可體外誘導為iNKT細胞,為iNKT細胞發(fā)育的研究及以iNKT為中心的細胞療法的建立提供了參考。
3.細胞輸注通過糾正RA小鼠體內(nèi)Th1/Th2Th17亞群及細胞因子免疫平衡紊亂,維持免疫耐受,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,具有潛
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