溫度影響體外培養(yǎng)大鼠精原細胞SCF-c-kit增殖通路及細胞周期.pdf

1、目的:通過在不同溫度下體外培養(yǎng)大鼠生精細胞,探討溫度對精原細胞SCF/c-kit增殖通路及細胞周期的影響,為進一步研究體腔溫度(37℃)導致精子發(fā)生障礙的機制提供基礎研究資料。
　　 方法:采用機械法和酶消化法分離雄性成年SD大鼠生精細胞,分別置于不同溫度(32℃、37℃)條件下與支持細胞進行體外共培養(yǎng),觀察其形態(tài)及細胞數(shù)變化等生長特性:培養(yǎng)第8天利用非連續(xù)密度梯度離心、差異性貼壁分離富集A型精原細胞:流式細胞技術檢測細胞周期:

2、實時定量.多聚酶鏈反應(Realtime-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)和蛋白免疫印跡(WesternBlot)分別檢測SCF/c-kit增殖通路中c-kit及下游基因PI3K、CyclinD3mRNA和蛋白的表達;Sanger雙脫氧法檢測c-kit基因第9、11、13號外顯子序列。
　　 結(jié)果:體外共培養(yǎng)第1天,32℃組、37℃組均可見懸浮的呈圓形或卵圓形的生精細胞和貼壁的呈長梭形或不規(guī)則形的支

3、持細胞;前3天,生精細胞數(shù)及生長狀態(tài)沒有明顯的區(qū)別,從第4天開始,37℃組的生精細胞數(shù)、生長狀態(tài)逐漸降低,第4天時,37℃組的生精細胞數(shù)為3.11±0.18×106/ml,32℃組為3.40±0.25×106/ml,第8天時,37℃生精細胞數(shù)為0.49±0.25×106/ml,明顯低于32℃組的2.93±0.26×106/ml,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05):體外共培養(yǎng)第8天,percoll分離結(jié)合差速貼壁法成功分離富集出A型精原細胞

4、,流式結(jié)果顯示32℃組處于S期A型精原細胞所占比例為49.35±1.04,明顯高于37℃組的43.58±0.78;G0/G1期為40.99±0.76,明顯低于37℃組的46.45±0.92,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);實時定量.多聚酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)檢測結(jié)果顯示:32℃組和37℃組A型精原細胞中均有c-kit、PI3K及CyclinD3mRNA和蛋白的表達,且32℃組中A型精原細胞c

5、-kit、PI3K及CyclinD3mRNA和蛋白的表達量均高于37℃組,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);基因測序結(jié)果顯示32℃組c-kit基因第9、11、13號外顯子均未見突變,37℃組第11、13號外顯子未見突變,第9號外顯子見套峰,提示在9號外顯子附近區(qū)域可能有缺失或插入突變。
　　 結(jié)論:在含有FBS的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中體腔溫度(37℃)影響體外培養(yǎng)大鼠精原細胞的增殖,同時可能導致c-kit基因發(fā)生突變;3