T-Synthase對(duì)卵巢上皮性癌中相關(guān)TCAC表達(dá)的影響及相關(guān)功能研究.pdf

1、背景:卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)腫瘤之一，病死率幾乎占婦科腫瘤之首，對(duì)婦女的生命造成嚴(yán)重威脅。由于卵巢癌具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)，大約3/4的患者就診時(shí)已屬晚期。手術(shù)治療聯(lián)合化療能一定的延長(zhǎng)患者生存期，但卵巢癌的死亡率和復(fù)發(fā)率仍然較高，五年生存率仍然較低，因此，臨床上迫切需要新的能用于卵巢癌早期診斷和治療的分子標(biāo)志物，尋找新的卵巢癌相關(guān)分子是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。
　　目前，臨床上診斷癌癥主要依賴于影像，生物標(biāo)志物，臨床分

2、期以及其他的一些病理學(xué)分析，細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)生改變被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的標(biāo)志。現(xiàn)在人們普遍認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的糖基化發(fā)生改變也可以作為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志，如CA-125，Tn和Sialyl Tn，它們都是糖基化蛋白，經(jīng)常作為生物學(xué)標(biāo)志物來(lái)診斷癌癥。其中，Tn抗原是一種腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原，通常不在外圍的組織和血細(xì)胞中表達(dá)，但是卻在人類(lèi)各種類(lèi)型的癌細(xì)胞中表達(dá)，Tn抗原主要來(lái)源于一個(gè)正常的O-糖基化通路，即聚糖從共同的前體GalNAcα1-O-

3、絲氨酸/蘇氨酸擴(kuò)展受到阻塞。該前體是在高爾基體中由一個(gè)家族多肽的產(chǎn)生的α-N-乙酰氨基半乳糖（ppGalNAcTs）糖蛋白，然后延伸到由單個(gè)酶稱(chēng)為T(mén)合酶（核心1β3半乳糖或C1GalT）組成的共同的核心O聚糖Galβ1-3GalNAcα1-OSer/蘇氨酸（T抗原）。形成的T-合酶活性形式需要獨(dú)特的分子伴侶稱(chēng)為Cosmc，該Cosmc（Xq24在人類(lèi)，XC3小鼠）在X染色體上編碼。Cosmc駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），并防止錯(cuò)誤折疊，聚集新合

4、成的T-合酶，防止蛋白酶體的降解。活性的T-合酶或Cosmc的表達(dá)缺失可導(dǎo)致Tn抗原的表達(dá)，以及影響它的唾液酸化的唾液酸Tn抗原在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)。
　　目前關(guān)于腫瘤相關(guān)性碳水化合物抗原在卵巢癌中的研究尚不多見(jiàn)，T-Synthase, T, Tn和S-Tn在卵巢癌以及正常卵巢組織中的表達(dá)情況如何，它們定位于何處，以及它們與分子伴侶Cosmc基因有何密切的關(guān)系，它們?cè)谀[瘤的形成過(guò)程中起著什么關(guān)鍵性的作用，這都有待我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行研

5、究。
　　目的:
　　1.明確T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢上皮性癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)及分布；
　　2.明確T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)；
　　3.明確不同表達(dá)狀態(tài)下的Cosmc在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　方法:
　　1.收集卵巢上皮性癌組織切片和卵巢上皮性癌新鮮組織，通過(guò)免疫組織化學(xué)和Western Blot的方法檢測(cè)卵巢上皮性

6、癌組織和正常卵巢組織中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的分布和表達(dá)；
　　2.通過(guò)培養(yǎng)兩種卵巢癌細(xì)胞系，制作細(xì)胞爬片，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的分布和表達(dá)，同時(shí)，運(yùn)用Western Blot的方法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞系中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的表達(dá)情況；
　　3.構(gòu)建Cosmc過(guò)表達(dá)慢病毒載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，通過(guò)Western Blot

7、的方法檢測(cè)細(xì)胞系中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原分子表達(dá)的變化，闡明T-Synthase唯一分子伴侶Cosmc表達(dá)的高低對(duì)TCAC表達(dá)的影響，然后，通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Cosmc表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cosmc表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.正常卵巢組織和卵巢上皮性癌組織中T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原的表達(dá)。
　

8、　運(yùn)用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)60例癌組織和20例正常組織進(jìn)行T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原表達(dá)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-Synthase主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯下調(diào)；T抗原主要定位于腺腔表面和外周細(xì)胞表面，其在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯下降；Tn抗原主要存在于胞漿內(nèi)，其在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯增高；S-Tn抗原主要定位于胞漿內(nèi)，在卵巢上皮性癌組織中，S-Tn抗原的

9、表達(dá)較正常組織明顯上升。
　　Western Blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)20例新鮮正常卵巢組織與48例卵巢上皮性癌組織樣本進(jìn)行T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原表達(dá)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在卵巢上皮性癌組織中T-Synthase和T抗原的表達(dá)較正常組織明顯下調(diào)，而Tn、S-Tn的表達(dá)在卵巢上皮性癌組織中較正常組織上升明顯，此結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。
　　2.卵巢癌細(xì)胞系Skov3和A2780中T-Synthase、T、T

10、n和S-Tn抗原的表達(dá)。
　　免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞系Skov3和A2780細(xì)胞爬片中T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，T-Synthase、T抗原在Skov3和A2780細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，而Tn和S-Tn抗原在Skov3和A2780細(xì)胞中出現(xiàn)中度表達(dá)或高表達(dá)，且S-Tn比Tn的陽(yáng)性率和敏感性更高。
　　Western Blotting檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞Skov3、A2780中C

11、osmc、T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cosmc、T-Synthase、T抗原表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞中均不高，而Tn和S-Tn抗原在 Skov3、A2780細(xì)胞呈高表達(dá)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，表明T-Synthase活性的降低抑制了T抗原的表達(dá)。
　　3.Cosmc過(guò)表達(dá)對(duì)相關(guān)分子表達(dá)的影響以及其在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　卵巢癌細(xì)胞A2780和Skov3培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)染C

12、osmc慢病毒，熒光顯微鏡下測(cè)轉(zhuǎn)染效率，熒光強(qiáng)度高，轉(zhuǎn)染效果在80％以上。同時(shí)，采用Western Blot檢測(cè)Cosmc的表達(dá)，轉(zhuǎn)染Cosmc慢病毒的細(xì)胞組較轉(zhuǎn)染空白對(duì)照的細(xì)胞，Cosmc的表達(dá)量明顯增加，且提高量大于2倍。通過(guò)Western Blot檢測(cè)Cosmc過(guò)表達(dá)后，T-Synthase、T、Tn、S-Tn抗原的表達(dá)的變化，其結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Cosmc后，其分子伴侶T-Synthase的表達(dá)顯著上升，且T抗原的表達(dá)也相應(yīng)增加，

13、而相應(yīng)的Tn和S-Tn抗原的表達(dá)則受到抑制，表明Cosmc可通過(guò)上調(diào)T-Synthase從而促進(jìn)T抗原的形成，并抑制Tn和S-Tn抗原的表達(dá)。
　　通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染Cosmc慢病毒的Skov3和A2780細(xì)胞的凋亡數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cosmc過(guò)表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞Skov3+和A2780+的凋亡數(shù)較對(duì)照組細(xì)胞Skov3和A2780明顯增加，通過(guò)MTT法檢測(cè)Cosmc對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Cosmc的細(xì)胞其生

14、長(zhǎng)能力明顯下降，此結(jié)果表明Cosmc過(guò)表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡并抑制其生長(zhǎng)。
　　通過(guò)分別對(duì)轉(zhuǎn)染Cosmc慢病毒的Skov3+和A2780+細(xì)胞進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)Cosmc對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Cosmc的細(xì)胞穿過(guò)小室膜的數(shù)量比對(duì)照組明顯減少，Cosmc過(guò)表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)論:
　　1. T-Synthase、T抗原在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常卵巢組織