硼替佐米調(diào)控泛素連接酶E3家族成員表達(dá)水平對(duì)前列腺癌抑制作用的分析.pdf

1、目的:前列腺癌是危害全世界男性健康的首要惡性腫瘤之一，在歐美等西方國家前列腺癌的年發(fā)病率居男性腫瘤的第1位，死亡率居第2位，在我國，前列腺癌發(fā)病率已躍居為男性惡性腫瘤的第3位。前列腺癌常為隱匿發(fā)病，確診時(shí)多已經(jīng)發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移，其高死亡率及高術(shù)后復(fù)發(fā)率主要與其易轉(zhuǎn)移有關(guān)，死于前列腺癌的患者中85％～100％合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。前列腺癌細(xì)胞最遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移部位是骨，晚期前列腺癌骨轉(zhuǎn)移十分常見。大多數(shù)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌會(huì)發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌，因

2、此常規(guī)的內(nèi)分泌治療效果不理想。目前針對(duì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌尚無有效的治療方法，預(yù)后極差，生存期一般短于2年。因此，深入探討前列腺癌發(fā)生機(jī)制，找尋治療前列腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)及切實(shí)有效的治療藥物迫在眉睫。泛素連接酶E3具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定質(zhì)膜蛋白、降解錯(cuò)誤蛋白與抑癌因子等多種作用，參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。泛素連接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1均包括一個(gè)C2區(qū)域，2-4個(gè)WW區(qū)域和一個(gè)HECT區(qū)域，故具有相似的功能與共同的特性。

3、大量的研究指出泛素連接酶E3家族成員與前列腺癌的發(fā)生、遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如研究發(fā)現(xiàn)WWP1在多種侵襲性前列腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)，而且下調(diào)WWP1表達(dá)水平可導(dǎo)致癌細(xì)胞生長抑制。硼替佐米是一種新型泛素-蛋白酶體通路抑制劑，目前主要作為抗多發(fā)性骨髓瘤藥物應(yīng)用于臨床，雖有研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米可抑制前列腺癌發(fā)生及浸潤，且可抑制腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但具體量-效關(guān)系、時(shí)間-效果關(guān)系及其作用機(jī)制尚不明確，已有資料提示硼替佐米對(duì)泛素連接酶E3 Smurf1、

4、Smurf2及WWP1表達(dá)水平亦有調(diào)節(jié)作用。本研究旨在分析探討硼替佐米通過調(diào)控泛素連接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1的表達(dá)水平，從而對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用，為Smurf1、Smurf2及WWP1作為前列腺癌治療新靶點(diǎn)及硼替佐米應(yīng)用于前列腺癌治療提供依據(jù)。
　　本研究應(yīng)用一系列實(shí)驗(yàn)方法，通過檢測(cè)藥物處理對(duì)雄激素非依賴性人前列腺癌PC3細(xì)胞株的細(xì)胞增殖率、Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA及蛋白表達(dá)水

5、平的影響，進(jìn)而探索硼替佐米對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的作用模式及機(jī)制。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)在嚴(yán)格無菌的環(huán)境下，將人前列腺癌PC3細(xì)胞接種于含DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞匯合度達(dá)90～95％時(shí)，以胰蛋白酶進(jìn)行消化，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待傳至3-5代后取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2、分組
　　2.1空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何藥物處理）;

6、r>　　2.2硼替佐米處理組(硼替佐米濃度梯度設(shè)置為:0.5、5、15、25μmol/L，作用時(shí)間:24h、48 h，72 h)
　　3、細(xì)胞增殖率測(cè)定采用Brdu ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞增殖情況及其活性變化。
　　4、細(xì)胞泛素連接酶Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平測(cè)定硼替佐米處理PC3細(xì)胞72小時(shí)后，提取細(xì)胞內(nèi)RNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time-PCR，Real Time-Polym

7、erase Chain Reaction)對(duì)各組細(xì)胞泛素連接酶WWP1、Smurf1及Smurf2 mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　5、細(xì)胞泛素連接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達(dá)水平測(cè)定硼替佐米處理PC3細(xì)胞72小時(shí)后，提取蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。應(yīng)用Western blotting方法對(duì)各組細(xì)胞泛素連接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究所得數(shù)據(jù)均錄入S

8、PSS18.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，應(yīng)用SNK-t檢驗(yàn)法進(jìn)行兩組比較，單因素方差分析AVON進(jìn)行多組比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、Brdu ELISA結(jié)果顯示:
　　1.1于藥物處理后24 h、48 h及72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，相較于對(duì)照組，硼替佐米處理組PC3細(xì)胞增殖率均顯著降低(P＜0.05)，且PC3細(xì)胞增殖率與硼替佐米使用劑量負(fù)相關(guān)，即硼替佐米濃度越高

9、，對(duì)PC3細(xì)胞增值率抑制作用越強(qiáng)，PC3細(xì)胞增值率數(shù)值越低，呈現(xiàn)劑量依賴性，且在25μmol/L的濃度下抑制作用最為顯著;
　　1.2在藥物濃度分別為5、15及25μmol/L的硼替佐米處理組中，PC3細(xì)胞增值率與處理時(shí)間長短負(fù)相關(guān)，即硼替佐米處理時(shí)間越長，對(duì)PC3細(xì)胞增值率抑制作用越強(qiáng)，PC3細(xì)胞增值率數(shù)值越低，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
　　2、Real time-PCR結(jié)果顯示:
　　經(jīng)藥物處理72 h后，相較于對(duì)照組，硼

10、替佐米處理組PC3細(xì)胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平顯著降低(P＜0.05)，且在一定范圍內(nèi)Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平與硼替佐米使用劑量負(fù)相關(guān)，即硼替佐米濃度越高，PC3細(xì)胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平越低，呈現(xiàn)劑量依賴性，且在25μmol/L的濃度下效果最為顯著。
　　3、Western blotting結(jié)果顯示:
　　經(jīng)藥物處理72 h后，相較于對(duì)

11、照組，硼替佐米處理組PC3細(xì)胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，且在一定范圍內(nèi)Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達(dá)水平與硼替佐米使用劑量負(fù)相關(guān)，即硼替佐米濃度越高，PC3細(xì)胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表達(dá)水平越低，呈現(xiàn)劑量依賴性，且在25μmol/L的濃度下效果最為顯著。
　　結(jié)論:
　　1、硼替佐米對(duì)雄激素非依賴性人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖率的抑制作用在一定范