Drp1、BAX、BCL2在糖尿病小鼠腎組織的表達(dá)變化及白藜蘆醇對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:通過動物實(shí)驗(yàn)觀察線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、氧化應(yīng)激指標(biāo)谷胱甘肽(glutathione，GSH)、錳超氧化物歧化酶(manganesesuperoxidedismutase，Mn-SOD)以及凋亡相關(guān)指標(biāo)BAX、BCL2在糖尿病小鼠腎臟表達(dá)的變化，并探究白藜蘆醇對糖尿病小鼠腎臟有無保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制，為臨床尋求糖尿病腎病(DiabeticNephropathy，DN)治療新靶點(diǎn)和有效藥物提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

2、方法:選用健康清潔級雄性10周齡CD-1小鼠90只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后統(tǒng)一于6％水合氯醛麻醉下行右腎切除術(shù)，術(shù)后兩周隨機(jī)分為兩組:對照組40只，模型組48只。模型組以一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）(140mg/Kg)方法制備糖尿病模型，對照組小鼠腹腔注射等容量枸櫞酸緩沖液。72小時(shí)后模型組不禁食斷尾取血測定血糖，連續(xù)兩次血糖高于16.7mmol/L者為造模成功。將對照組小鼠隨機(jī)分為兩組:正常對照組（A組）

3、20只、正常+白藜蘆醇對照組（B組）20只;造模成功的模型組小鼠隨機(jī)分為兩組:糖尿病組(C組)24只、糖尿病+白藜蘆醇治療組（D組）23只。成模后即開始白藜蘆醇灌胃干預(yù)，B、D組給予白藜蘆醇羧甲基纖維素鈉溶液5mg/kg/d，A、C組給予等量羧甲基纖維素鈉溶液。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食，不使用其他藥物。分別于藥物干預(yù)的第4、8、12周末各組隨機(jī)取6只小鼠留取血及腎組織標(biāo)本，處死前留取24小時(shí)尿、稱重、測尾尖血糖。檢測24小時(shí)尿蛋白定量;血清

4、生化指標(biāo):血肌酐(Scr)、尿素氮(Urea)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、血清GSH含量;腎組織石蠟切片行HE、PAS染色觀察腎臟病理變化;應(yīng)用免疫組化和Western-Blot方法檢測腎組織Drp1、BAX、BCL2的表達(dá)情況;提取腎皮質(zhì)蛋白行Mn-SOD活性檢測。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)均為正態(tài)分布，滿足方差齊性檢驗(yàn)行單因素方差分析(ANOVA)并進(jìn)一步兩兩比較（snk-t檢驗(yàn)），不滿

5、足方差齊性檢驗(yàn)則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，顯著性水平等于0.05，應(yīng)用SPSS13.0軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果:
　　 1、C組、D組小鼠在STZ注射4-5天后出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿、體重減輕，精神萎靡、活動減少，毛發(fā)萎黃脫落失去光澤，尾部、耳緣、四肢末梢顏色暗紅甚至紫紺，并逐漸出現(xiàn)脂肪重分布，即腹型肥胖;而A組、B組小鼠則無上述情況出現(xiàn)。給予白藜蘆醇治療后D組小鼠上述情

6、況較C組好轉(zhuǎn)。
　　 2、A、B組小鼠的體重、腎重/體重于4、8、12周末均無差異(P＞0.05)，C、D組小鼠體重明顯低于同期A組。D組小鼠體重于8周末開始高于C組(P＜0.05)，但仍低于A組。C組小鼠腎重/體重在整個(gè)試驗(yàn)期間最高，D組次之，A、B組最低（Fig.3-4;Table1）。
　　 3、A、B組小鼠血糖、24小時(shí)尿蛋白量、總膽固醇、甘油三酯、LDL、HDL、血肌酐、尿素于4、8、12周末均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

7、＞0.05）。
　　 C組小鼠血糖、24小時(shí)尿蛋白量明顯高于同期A組(P＜0.05），D組小鼠經(jīng)白藜蘆醇治療后24小時(shí)尿蛋白量顯著下降(P＜0.05)，但血糖與C組相比無差異(P＞0.05)(Fig.5-6;Table2)。
　　 C組小鼠血清總膽固醇、甘油三酯、LDL水平于8、12周末顯著高于A組(P＜0.05)，HDL于12周末顯著下降。D組小鼠總膽固醇、甘油三酯、LDL水平分別于8、8、12周末較C組顯著下降，HD

8、L也于12周末上調(diào)至正常水平(P＜0.05)(Fig.7-10;Table3-4)。
　　 C組小鼠成模后血清肌酐、尿素水平較A組明顯升高(P＜0.05)，D組小鼠肌酐、尿素水平經(jīng)白藜蘆醇治療8周后較C組明顯下降(P＜0.05)(Fig.11-12;Table5)。
　　 4、與同期A組相比，B組小鼠血清GSH含量、腎皮質(zhì)Mn-SOD活力總體均數(shù)有升高趨勢，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);C組小鼠血清GSH含量、腎

9、皮質(zhì)Mn-SOD活力較A組顯著下降(P＜0.05);D組小鼠經(jīng)白藜蘆醇治療后血清GSH含量、腎皮質(zhì)Mn-SOD活力顯著高于C組(P＜0.05)(Fig.13-14;Table6)。
　　 5、HE、PAS染色結(jié)果顯示C組小鼠腎小球體積明顯增大，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增多，系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚，腎小管管腔擴(kuò)張，部分刷毛緣脫落;D組小鼠上述變化輕于C組(Fig.15-18)。
　　 6、免疫組織化學(xué)、Western-Blot結(jié)

10、果顯示4、8、12周末A、B組小鼠腎皮質(zhì)Drp1、BCL2蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，B組小鼠腎皮質(zhì)BAX表達(dá)于8周、12周末較同期A組顯著下調(diào)(P＜0.05)。C組小鼠腎皮質(zhì)Drp1、BAX表達(dá)水平較同期A、B組顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，BCL2表達(dá)強(qiáng)度減弱(P＜0.05)。D組小鼠經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后能夠顯著改善上述變化(P＜0.05)(Fig.19-27;Table7-8)。
　　 結(jié)論:
　　 1、在糖

11、尿病小鼠模型中，Drp1在腎臟表達(dá)上調(diào)，腎皮質(zhì)Mn-SOD活力減低，血清GSH含量下降，同時(shí)腎皮質(zhì)BAX上調(diào)，BCL2下調(diào)，該變化與24小時(shí)尿蛋白定量增加，腎功能下降、腎臟病理變化以及血脂代謝紊亂同時(shí)出現(xiàn)。這提示線粒體分裂過程、線粒體氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展;Drp1可能是糖尿病腎病治療的新靶點(diǎn)。
　　 2、白藜蘆醇干預(yù)后可改善糖尿病小鼠一般情況，降低24小時(shí)尿蛋白量，減輕腎臟病理變化，恢復(fù)部分腎功能，改