幾種不同NLS對重組酶刪除效率影響的初步研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因植物給人類帶來巨大經(jīng)濟價值的同時也存在生物安全隱患，因此，近年來人們一直探索如何消除轉(zhuǎn)基因植物可能帶來的生物安全性問題。已經(jīng)證實，來源于微生物的位點特異性重組酶系統(tǒng)能有效刪除轉(zhuǎn)基因植物中的抗性選擇抗性標記基因，現(xiàn)己廣泛應用于轉(zhuǎn)基因植物生物安全控制中。前期工作中，本實驗室以重組酶系統(tǒng)Cre/loxP與FLP/FRT為基礎，構建了一個新的基因刪除系統(tǒng)“Gene—deletor”。為了進一步提高該系統(tǒng)的刪除效率，本論文在已有研究基礎上，

2、重點研究了核定位信號序列(nuclear localization signal，NLS)對重組酶Cre刪除效率的影響。為此合成了四種被證實在多數(shù)植物中起作用的核定位信號，將它們分別與GFP：：GUS基因融合構建表達載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化手段將其轉(zhuǎn)入煙草，篩選出入核效率最高的NLS；再將其與重組酶基因Cre融合構建表達載體，遺傳轉(zhuǎn)化煙草，初步分析了NLS融合于Cre的N端對其入核及刪除效率的影響。主要結(jié)果如下： 1．不同類型NLS協(xié)

3、助蛋白入核效率比較分析 為了提高重組酶入核的效率，本論文選擇四種典型的NLS，分別為：單向的來自SV40大T抗原的SV40NLS；雙向的來自玉米轉(zhuǎn)錄因子Opaque-2的O2NLS；來自酵母蛋白Mat a-2的rpl25NLS(這個NLS只被importinβ識別)，以及類似Mat a-2NLS的來自玉米轉(zhuǎn)錄因子的NLSC。將它們分別與標記基因(GFP：：GUS)融合，構建融合表達載體，并轉(zhuǎn)化煙草，確定獲得雙功能活性的GFP：G

4、US融合基因后；比較NLSs介導GFP：：GUS融合蛋白入核的效率。 首先，對葉片上皮細胞GFP熒光的定性觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因pBI—SV40NLS—GFP：：GUS細胞層的熒光明顯集中于細胞核；其他融合了核定位信號的轉(zhuǎn)基因植物細胞與未融合NLS的轉(zhuǎn)基因植物細胞中，熒光信號多呈現(xiàn)彌散分布，沒有聚集的相對較強的熒光信號；非轉(zhuǎn)基因植株中未檢測到任何熒光信號。 核蛋白GUS酶活定量檢測發(fā)現(xiàn)：pBI—SV40NLS—GFP：：G

5、US植株的核內(nèi)GUS酶活在90-380U之間，明顯高于pBI—GFP：：GUS與其他融合NLS的轉(zhuǎn)基因植株，大約是它們的2-4倍。 2．NLS對重組酶效率影響的初步研究 進一步將已合成的SV40NLS融合至重組酶Cre的N端，構建植物表達載體pBI—CaMV35S—Cre—NOS與pBI—CaMV35S—SV40NLS—Cre—NOS。由發(fā)根農(nóng)桿菌介導，二次轉(zhuǎn)化含特異識別位點的GUS陽性煙草pLFGN，獲得二次轉(zhuǎn)化的再生