Intralipid對(duì)重組鼠IL-12腺病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)探討通過(guò)QBI-293A細(xì)胞來(lái)完成重組腺病毒(Adv-mIL-12、Adv-EGFP)的擴(kuò)增、純化及效價(jià)檢測(cè)。(2)經(jīng)門(mén)靜脈注射不同劑量的Adv-mIL-12，探討注射劑量與IL-12表達(dá)量之間的關(guān)系。(3)探討經(jīng)門(mén)靜脈注射Adv-mIL-12時(shí)，應(yīng)用Intralipid對(duì)IL-12表達(dá)量的影響及對(duì)機(jī)體的毒性反應(yīng)，旨在為有效的利用Adv-mIL-12抗肝癌肝內(nèi)微轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)在10％的DMEM

2、培養(yǎng)基中，對(duì)QBI-293A細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，然后對(duì)重組腺病毒(Adv-mIL-12、Adv-EGFP)進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用氯化銫密度梯度離心法和TCID50法對(duì)腺病毒純化和效價(jià)檢測(cè)。(2)不同劑量的Adv-mIL-12(5×108Pfu/Rat、1×109Pfu/Rat、3×109Pfu/Rat、5×109Pfu/Rat、1×1010Pfu/Rat)經(jīng)門(mén)靜脈注射，ELISA法檢測(cè)血清及肝臟組織中72小時(shí)IL-12的表達(dá)含量，探討不同劑量的A

3、dv-mIL-12在血清和肝組織中IL-12表達(dá)情況；尾靜脈注射不同劑量的Intralipid(0mg、50mg、100mg、150mg、200mg)后，5×108Pfu/Rat劑量的Adv-mIL-12從門(mén)靜脈注射，72小時(shí)后ELISA法檢測(cè)不同劑量Intralipid對(duì)血清IL-12濃度的影響；再用150mg的Intralipid和5×109Pfu/Rat的Adv-mIL-12對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)對(duì)臟器勻漿，取組織上清液ELISA法

4、檢測(cè)72小時(shí)肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、心臟IL-12的表達(dá)量。(3)分單純Adv-mIL-12組、Intralipid組(脂肪乳+Adv-mIL-12)、Adv-EGFP組、Saline組(生理鹽水對(duì)照組)四組。觀察當(dāng)Adv-mIL-12、Adv-EGFP劑量為5×109Pfu/ Rat和Intralipid為150mg時(shí)，血清中IL-12、IFN-γ的濃度隨時(shí)間變化的趨勢(shì)及ALT、AST情況，并在干預(yù)后1天，用CD68抗體對(duì)大鼠Kupf

5、fer細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并在顯微鏡下計(jì)數(shù)；ELISA法觀察急性炎癥因子TNF-α、IL-6在6小時(shí)的血清水平。 結(jié)果：(1)重組腺病毒Adv-mIL-12和Adv-EGFP經(jīng)擴(kuò)增、純化后效價(jià)分別約1.4×1010pfu/ml和2.0×1010pfu/ml。(2)注射較低病毒劑量(5×108～1×109Pfu/rat)Adv-mIL-12后，72小時(shí)檢測(cè)血清和肝臟中IL-12表達(dá)含量較低且出現(xiàn)平臺(tái)期，而當(dāng)劑量增加到3×109

6、Pfu/rat以后，血清和肝臟中IL-12含量明顯升高，至少達(dá)到了較低劑量下的3倍，和較低劑量下IL-12表達(dá)量比較均具有顯著性差異，且隨Adv-mIL-12劑量增加，IL-12表達(dá)量有明顯的增加：當(dāng)Adv-mIL-12劑量為5×108Pfu/Rat時(shí)，隨著Intralipid劑量的增加，血清中IL-12含量較Intralipid劑量為0時(shí)增加明顯，當(dāng)Intralipid劑量為150mg時(shí)血清中IL-12含量比未應(yīng)用Intralipid

7、時(shí)提高了2倍多，在劑量增至200mg時(shí)，我們隨后觀察到個(gè)別大鼠出現(xiàn)呼吸急促、進(jìn)食和活動(dòng)明顯減少的現(xiàn)象，應(yīng)用Intralipid血清中IL-12含量和未應(yīng)用時(shí)比較有顯著性差異；用150mg的Intralipid和5×109Pfu/Rat的Adv-mIL-12對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)72小時(shí)后，五個(gè)臟器(肝、脾、肺、腎、心)IL-12表達(dá)含量，肝臟中最高，這樣可以在肝臟局部形成高濃度的IL-12。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：肝臟和其它臟器中IL-12含量比較具有顯著

8、性差異。(3)各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血清中IL-12含量，Intralipid組明顯高于其它各組，各組IL-12血清含量在第3天達(dá)到最高，以后逐漸降低，在18天時(shí)，Intralipid組血清中仍然檢測(cè)出IL-12的表達(dá)；血清中IFN-γ含量除在第1天，Intralipid組小于Adv-EGFP組、單純Adv-mIL-12組外，其它各時(shí)間點(diǎn)Intralipid組均高于其它各組，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較具有顯著性差異；和Saline組相比，在第1天時(shí)，其它三組大鼠

9、Kupffer細(xì)胞數(shù)目減少，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但I(xiàn)ntralipid組Kupffer細(xì)胞數(shù)目的減少明顯少于單純Adv-mIL-12組和Adv-EGFP組；在實(shí)驗(yàn)第1天，除Saline組外，其它三組ALT、AST均有較明顯的升高，但I(xiàn)ntralipid組較其它腺病毒組升高明顯，在3天時(shí)，各組中ALT、AST即有明顯的降低，到18天時(shí)，ALT、AST數(shù)值已基本恢復(fù)正常；在實(shí)驗(yàn)6小時(shí)，和Saline組比較，其它三組血清急性炎癥因子TNF-α、I

10、L-6的水平明顯升高，具有顯著性差異，Intralipid組TNF-α的血清濃度在三個(gè)腺病毒組中最低，但I(xiàn)L-6的血清濃度最高，和其它兩個(gè)病毒組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：(1) QBI-293A細(xì)胞能夠?qū)dv-mIL-12、Adv-EGFP重組腺病進(jìn)行大量擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)對(duì)擴(kuò)增后的腺病毒進(jìn)行純化及病毒滴度檢測(cè)，能夠得到較高的病毒滴度。(2)經(jīng)門(mén)靜脈注射應(yīng)用Adv-mIL-12時(shí)，IL-12的表達(dá)存在閾值效應(yīng)：即當(dāng)應(yīng)用的病毒劑量超過(guò)

11、某一值時(shí)，其血清和肝臟IL-12表達(dá)量較前可大幅提高。(3)和直接門(mén)靜脈注射應(yīng)用Adv-mIL-12比較，在應(yīng)用Adv-mIL-12前通過(guò)大鼠尾靜脈注射一定量的Intralipid，可明顯提高血清中IL-12表達(dá)量；同時(shí)，應(yīng)用Intralipid后，各臟器IL-12表達(dá)含量比較，肝臟仍然最高。(4)門(mén)靜脈直接注射應(yīng)用Adv-mIL-12和在之前應(yīng)用Intralipid均可引起大鼠肝臟功能的暫時(shí)性損傷；和直接應(yīng)用Adv-mIL-12比較，