shRNA表達(dá)庫構(gòu)建方法研究.pdf

1、本論文針對shRNA表達(dá)庫的構(gòu)建做了三方面的工作：1、對現(xiàn)有的酶切法從cDNA構(gòu)建shRNA表達(dá)庫進(jìn)行了改進(jìn)，在降低技術(shù)難度的同時(shí)增加了庫的復(fù)雜度；2、開發(fā)了一種新的建庫方法構(gòu)建了隨機(jī)shRNA表達(dá)庫，為使用shRNA表達(dá)庫進(jìn)行功能基因的篩選提供了另一種選擇；3、研究了使用酶切法構(gòu)建cDNA來源的第二代shRNA表達(dá)庫和使用作者開發(fā)的方法構(gòu)建第二代隨機(jī)shRNA表達(dá)庫的可行性。 本研究從二個(gè)方面對酶切法進(jìn)行了改進(jìn)。首先我們增加

2、了一種限制性內(nèi)切酶CviK Ⅰ-1，我們隨機(jī)挑選了9種來自人和小鼠的cDNA來統(tǒng)計(jì)其上的酶切位點(diǎn)的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原方案使用的那幾種酶(HinpⅠ(GCGC)，BsaⅢ(GPuCGPyC)，AciⅠ(AACGTT)，HpaⅡ(CCGG)，HpyCH4Ⅳ(ACGT)and Taq αⅠ(TCGA))的位點(diǎn)分布很少，平均每Kb共存在5.4個(gè)酶切位點(diǎn)。而CviK Ⅰ-1酶切位點(diǎn)的分布為每Kb存在20個(gè)酶切位點(diǎn)。由此可知，原方案使用的那幾種內(nèi)切酶

3、在實(shí)際的操作中會(huì)導(dǎo)致較低的庫的復(fù)雜度，其在EGFP上酶切位點(diǎn)的較多分布只是一個(gè)特例。而增加CviKⅠ-1則可以使庫的復(fù)雜度得到較大的提高。此外，我們使用直接乙醇沉淀法對PAGE凝膠中擴(kuò)散出的50bp的小片段進(jìn)行回收。與原方案的柱回收相比，直接乙醇沉淀法可以得到較高的回收濃度和回收率，我們將該方法回收的片段用于下一步的連接和PCR實(shí)驗(yàn)中。發(fā)現(xiàn)該方法得到的DNA樣品不會(huì)對這些操作產(chǎn)生不利的影響。這兩點(diǎn)改進(jìn)使我們在降低技術(shù)難度的同時(shí)能夠得到較

4、高的復(fù)雜度。 本課題開發(fā)了一種新的方法，構(gòu)建了一種新型的shRNA表達(dá)庫一隨機(jī)shRNA表達(dá)庫。首先我們將人U6啟動(dòng)子插入慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建了shRNA的表達(dá)載體，由于建庫方法的要求，在啟動(dòng)子序列中引入了Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)。使用已知的針對EGFP的shRNA，檢測了啟動(dòng)子序列的改變和建庫所使用的shRNA loop對shRNA干擾活性的影響。經(jīng)過三步操作，化學(xué)合成的19nt隨機(jī)脫氧核苷酸片段能夠被轉(zhuǎn)化為雙鏈的shRNA編碼模版

5、，然后將其克隆到表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)化后隨機(jī)挑選20個(gè)克隆進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)庫的復(fù)雜度可以達(dá)到1.1×10<'7>，這意味著針對一個(gè)1kb的mRNA，庫中會(huì)有110條針對它的shRNA存在。與酶切法構(gòu)建的cDNA來源的shRNA表達(dá)庫相比，隨機(jī)庫有著許多的優(yōu)點(diǎn)。這種隨機(jī)庫的構(gòu)建為使用shRNA表達(dá)庫進(jìn)行功能基因的篩選提供了另一種選擇。 使用酶切法將cDNA片段插入miRNA的框架之中時(shí)，需要對miRNA的側(cè)翼序列，莖部的長度進(jìn)行一定的改

6、變，構(gòu)建隨機(jī)的shKNA表達(dá)庫也需要改變miRNA的側(cè)翼序列。為了弄清楚這些改變是否會(huì)對miRNA的加工成熟及RISC的裝配產(chǎn)生影響，本課題利用綠色熒光蛋白作為報(bào)告系統(tǒng)，構(gòu)建了針對EGFP的shRNA-mir的三種突變體，一種是側(cè)翼序列突變體，另外兩種是莖部長度突變體，研究了這些改變對最終RNA干擾效果的影響。結(jié)果表明，側(cè)翼序列的改變對shRNA-mir的干擾活性沒有影響，而莖部長度的增加，即使是僅有3bp的增加，都會(huì)對shRNA-mi