shRNA表達庫構(gòu)建方法研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本論文針對shRNA表達庫的構(gòu)建做了三方面的工作:1、對現(xiàn)有的酶切法從cDNA構(gòu)建shRNA表達庫進行了改進,在降低技術(shù)難度的同時增加了庫的復(fù)雜度;2、開發(fā)了一種新的建庫方法構(gòu)建了隨機shRNA表達庫,為使用shRNA表達庫進行功能基因的篩選提供了另一種選擇;3、研究了使用酶切法構(gòu)建cDNA來源的第二代shRNA表達庫和使用作者開發(fā)的方法構(gòu)建第二代隨機shRNA表達庫的可行性。 本研究從二個方面對酶切法進行了改進。首先我們增加

2、了一種限制性內(nèi)切酶CviK Ⅰ-1,我們隨機挑選了9種來自人和小鼠的cDNA來統(tǒng)計其上的酶切位點的分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)原方案使用的那幾種酶(HinpⅠ(GCGC),BsaⅢ(GPuCGPyC),AciⅠ(AACGTT),HpaⅡ(CCGG),HpyCH4Ⅳ(ACGT)and Taq αⅠ(TCGA))的位點分布很少,平均每Kb共存在5.4個酶切位點。而CviK Ⅰ-1酶切位點的分布為每Kb存在20個酶切位點。由此可知,原方案使用的那幾種內(nèi)切酶

3、在實際的操作中會導(dǎo)致較低的庫的復(fù)雜度,其在EGFP上酶切位點的較多分布只是一個特例。而增加CviKⅠ-1則可以使庫的復(fù)雜度得到較大的提高。此外,我們使用直接乙醇沉淀法對PAGE凝膠中擴散出的50bp的小片段進行回收。與原方案的柱回收相比,直接乙醇沉淀法可以得到較高的回收濃度和回收率,我們將該方法回收的片段用于下一步的連接和PCR實驗中。發(fā)現(xiàn)該方法得到的DNA樣品不會對這些操作產(chǎn)生不利的影響。這兩點改進使我們在降低技術(shù)難度的同時能夠得到較

4、高的復(fù)雜度。 本課題開發(fā)了一種新的方法,構(gòu)建了一種新型的shRNA表達庫一隨機shRNA表達庫。首先我們將人U6啟動子插入慢病毒表達載體構(gòu)建了shRNA的表達載體,由于建庫方法的要求,在啟動子序列中引入了Xho Ⅰ酶切位點。使用已知的針對EGFP的shRNA,檢測了啟動子序列的改變和建庫所使用的shRNA loop對shRNA干擾活性的影響。經(jīng)過三步操作,化學(xué)合成的19nt隨機脫氧核苷酸片段能夠被轉(zhuǎn)化為雙鏈的shRNA編碼模版

5、,然后將其克隆到表達載體中。轉(zhuǎn)化后隨機挑選20個克隆進行測序,發(fā)現(xiàn)庫的復(fù)雜度可以達到1.1×10<'7>,這意味著針對一個1kb的mRNA,庫中會有110條針對它的shRNA存在。與酶切法構(gòu)建的cDNA來源的shRNA表達庫相比,隨機庫有著許多的優(yōu)點。這種隨機庫的構(gòu)建為使用shRNA表達庫進行功能基因的篩選提供了另一種選擇。 使用酶切法將cDNA片段插入miRNA的框架之中時,需要對miRNA的側(cè)翼序列,莖部的長度進行一定的改

6、變,構(gòu)建隨機的shKNA表達庫也需要改變miRNA的側(cè)翼序列。為了弄清楚這些改變是否會對miRNA的加工成熟及RISC的裝配產(chǎn)生影響,本課題利用綠色熒光蛋白作為報告系統(tǒng),構(gòu)建了針對EGFP的shRNA-mir的三種突變體,一種是側(cè)翼序列突變體,另外兩種是莖部長度突變體,研究了這些改變對最終RNA干擾效果的影響。結(jié)果表明,側(cè)翼序列的改變對shRNA-mir的干擾活性沒有影響,而莖部長度的增加,即使是僅有3bp的增加,都會對shRNA-mi

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