小鼠EMSP1基因敲除載體構(gòu)建及ES細胞飼養(yǎng)層制作研究.pdf

1、胚胎干細胞體外成功培養(yǎng)與基因打靶技術(shù)相結(jié)合使人類可以改變動物的遺傳性狀，獲得人為改造的動物模型。建立小鼠模型是基因打靶的主要熱點，首先在胚胎干細胞水平進行操作，獲得表達目的基因的單克隆細胞，爾后將細胞進行囊胚腔注射，得到表達目的基因的嵌合體小鼠，再進一步培育出整合于生殖系的小鼠品系，這一套技術(shù)路線在制備基因剔除小鼠時已經(jīng)被成功地運用。該技術(shù)的優(yōu)點之一是可以對每個單克隆細胞進行分析，并由此培育出單克隆細胞發(fā)育而來的小鼠。同時，本實驗過程中

2、采用的基因敲除及胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù)為將來開展動物基因敲除奠定技術(shù)基礎(chǔ)。 本研究對EMSP1基因組序列進行分析并結(jié)合GenBank上提供的小鼠釉基質(zhì)絲氨酸蛋白酶基因序列(10134bp)，采用Oligo6.0軟件設(shè)計兩對引物，以129小鼠尾采血提取得到的DNA為模板，分別擴增長為5.0kb和1.7kb的片段作為同源長短臂。然后將回收的同源長短臂克隆入pGEM -T載體上，經(jīng)過PCR及酶切鑒定，以及DNA核苷酸序列分析，證實長短臂的

3、同源率分別為97.43％和98.10％。將同源長臂經(jīng)Sal Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切，同源短臂經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后分別插入通用型基因敲除載體pSSC-9的正向篩選基因Neo兩側(cè)多克隆位點，成功構(gòu)建了小鼠EMSP1基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm。 在胚胎干細胞飼養(yǎng)層制作中選用11.5～14.5天ICR小鼠胚胎為材料，采用膠原酶消化的方法，分離成纖維細胞，培養(yǎng)幾代去除雜細胞后用于小鼠胚胎干細胞飼養(yǎng)層制作實驗。將培養(yǎng)

4、狀態(tài)良好的小鼠胚胎成纖維細胞計數(shù)后，利用不同濃度的絲裂霉素C處理適當(dāng)時間且計算好細胞數(shù)后，鋪成單細胞層的胚胎干細胞飼養(yǎng)層，體外培養(yǎng)觀察飼養(yǎng)層細胞的生長狀態(tài)。經(jīng)實驗分析比較認為：以12.5天ICR小鼠胚胎為材料的成纖維細胞分離培養(yǎng)的效果良好，原代培養(yǎng)的第二代到第五代可以用于胚胎干細胞飼養(yǎng)層的制作。當(dāng)絲裂霉素C處于10mg/L的濃度時，處理細胞濃度為3×10<'5>個/ml的小鼠胚胎成纖維細胞2小時，獲得的飼養(yǎng)層細胞狀態(tài)較好，符合胚胎干細胞