不同倍性魚cdc2基因cDNA部分序列的克隆及其在卵巢中的表達(dá)分析.pdf

1、異源四倍體鯽鯉是世界上首例人工培育的兩性可育的四倍體魚，為探討自然界多倍體的形成機(jī)制提供了非常重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料。用雄性異源四倍體鯽鯉與雌性二倍體日本白鯽(Carassiusauratuscuvieri)交配產(chǎn)生了具有生長優(yōu)勢(shì)的三倍體湘云鯽(allotriploidcruciancarp)。異源四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體卵子經(jīng)紫外線滅活的散鱗鏡鯉的精子激活，獲得了大量雌核發(fā)育二倍體鯽鯉后代(G1)；GI早期性腺中的卵原細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂

2、前核內(nèi)復(fù)制并產(chǎn)生大量的二倍體卵子，這些卵子經(jīng)紫外線滅活的散鱗鏡鯉精子激活，獲得了第二代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G2)；用類似的方法，目前，已獲得了第三代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G3)。該雌核發(fā)育二倍體鯽鯉克隆體系為研究核內(nèi)復(fù)制分子機(jī)制提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)材料。 本文以這些實(shí)驗(yàn)魚為材料，對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控基因cdc2進(jìn)行了一系列研究。cdc2基因最早是在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的，研究表明，脊椎動(dòng)物中cdc2基因的產(chǎn)物p34cdc2(即Cdc2)與cycl

3、inB結(jié)合形成MPF并協(xié)同啟動(dòng)G2期向M期的過渡。本文通過3'-Race和PCR方法，獲得G3、二倍體紅鯽、三倍體湘云鯽、異源四倍體鯽鯉cdc2基因cDNA部分序列，并用RT-PCR及Real-timePCR方法檢測(cè)不同倍性魚卵巢中的表達(dá)水平。 ①cdc2基因cDNA部分序列的克隆 克隆獲得cdc2基因cDNA部分序列，根據(jù)這些序列推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列，并對(duì)同源性進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：魚類cdc2基因的氨基酸序列具

4、有高度的保守性，在異源四倍體鯽鯉、三倍體湘云鯽、二倍體紅鯽、G3、金魚、斑馬魚、虹鱒魚、日本虹鱒魚、還有鱸魚中，同源性為89.0-99.5％不等。其中，本實(shí)驗(yàn)克隆的四種鯉科魚類(異源四倍體鯽鯉、三倍體湘云鯽、紅鯽、G3)與同為鯉科的金魚、斑馬魚同源性較高，與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的虹鱒魚、日本虹鱒魚、鱸魚同源性相對(duì)較低。 ②cdc2基因在異源四倍體鯽鯉、三倍體湘云鯽和二倍體紅鯽卵巢中的表達(dá)分析 RT-PCR及Real-timePC

5、R實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：同一時(shí)期三個(gè)不同倍性魚卵巢中均有cdc2的表達(dá)，二倍體紅鯽、三倍體湘云鯽、異源四倍體鯽鯉中cdc2mRNA的起始相對(duì)拷貝數(shù)分別為100、100.87和101.44，出現(xiàn)了隨倍性的遞增而依次升高的現(xiàn)緣。我們推測(cè)這種現(xiàn)象可能與p34cdc2凝集染色體的相應(yīng)功能有關(guān)。 ③cdc2基因在雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G3)和二倍體對(duì)照(紅鯽)卵巢中的表達(dá)分析 RT-PCR及Real-timePCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雌核發(fā)育二倍